樹突狀細(xì)胞在1型糖尿病免疫耐受中的作用研究.pdf

1、目的：探討自身抗原牛胰島素誘導(dǎo)免疫耐受防止1型糖尿?。═1D）模型小鼠發(fā)病的作用及其機(jī)制；研究體內(nèi)樹突狀細(xì)胞（DC）及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在自身抗原胰島素誘導(dǎo)T1D小鼠免疫耐受中的作用；通過過繼動物體內(nèi)處理及體外修飾的耐受性DC，觀察其對T1D發(fā)病的影響并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 (1)低劑量鏈脲佐菌素（STZ）（40 mg/kg）連續(xù)5次腹腔注射建立BALB/c小鼠T1D模型。造模前1天采用自身抗

2、原進(jìn)行免疫干預(yù)，皮下注射牛胰島素與不完全弗氏佐劑（IFA，1：1）混合乳劑1次（100 μg/只），以后每周1次，連續(xù)4 w；
　　 灌胃給以胰島素PBS液（150μg/只），以后每周給藥2次，連續(xù)4 w。每周測定血糖，6周后處死所有動物，取胰腺進(jìn)行HE染色作病理組織學(xué)檢查，采用原位末端標(biāo)記法作胰島β細(xì)胞凋亡檢測。分離脾臟淋巴細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，MTT法測定小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。ELISA法測定血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ

3、、IL-4和IL-10的含量。
　　 (2)上述實驗結(jié)束處死動物過程中，分離骨髓DC前體及脾臟淋巴細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-4誘導(dǎo)DC產(chǎn)生。采用流式細(xì)胞術(shù)（FACS）測定DC表型和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。同種淋巴細(xì)胞刺激實驗檢測DC刺激淋巴細(xì)胞增殖功能。ELISA法測定DC分泌IL-12p70的量。
　　 (3)體外分離BALB/c小鼠骨髓前體細(xì)胞，于GM-CSF

4、+IL-4條件下培養(yǎng)的DC為DC0，僅GM-CSF培養(yǎng)為DC1，GM-CSF+IL-4+人工蟲草（PHC）提取物條件下培養(yǎng)的為DC2。自身抗原胰島素皮下注射誘導(dǎo)T1D模型小鼠耐受，于耐受小鼠體內(nèi)提取的DC為DC3。通過FACS分析測定細(xì)胞表面抗原，ELISA法測定DC分泌IL-12 p70的量，MLR測定DC刺激功能。將上述DC過繼至BALB/c小鼠體內(nèi)。
　　 采用低劑量STZ（40 mg/kg）連續(xù)5次腹腔注射建立小鼠T1D

5、模型。每周測定血糖，4周后處死所有動物，取胰腺進(jìn)行HE染色作病理組織學(xué)檢查，采用TUNEL原位末端標(biāo)記法作胰島β細(xì)胞凋亡檢測。分離脾臟淋巴細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，測定小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群比例。ELISA法測定血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10的含量。
　　 結(jié)果：
　　 (1)采用STZ小劑量連續(xù)腹腔注射可在小鼠體內(nèi)建立穩(wěn)定的以胰腺β細(xì)胞炎性破壞為主要病理特征的T1D

6、模型。與模型組相比，胰島素sc組血糖值明顯降低（P<0.05）,而胰島素po組則無明顯差異。胰腺HE染色發(fā)現(xiàn)模型組胰腺有明顯的炎性細(xì)胞浸潤，而胰島素sc組胰島基本無浸潤。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰島素皮下注射可有效減少β細(xì)胞凋亡。與模型組相比，胰島素sc組脾淋巴細(xì)胞增殖能力降低（P<0.05）。胰島素皮下注射可有效抑制IL-2和IFN-γ分泌，而提高IL-4和IL-10的含量。
　　 (2)少量多次STZ誘導(dǎo)的T1D模型小鼠骨

7、髓前體在GM-CSF和IL-4的誘導(dǎo)下難以分化為正常的DC，細(xì)胞表面CD11c呈低水平表達(dá)。胰島素皮下注射誘導(dǎo)小鼠耐受后，小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞CD11c表達(dá)正常，但共刺激分子和MHC-II分子表達(dá)下降，呈現(xiàn)不成熟DC(iDC)的狀態(tài)；與正常小鼠來源的成熟狀DC(mDC)相比，IL-12 p70分泌量下降，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中DC刺激能力減弱。模型對照組脾臟CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量較低，胰島素自身抗原連續(xù)應(yīng)用后，CD4+CD25

8、+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量明顯上升。
　　 (3)多種方式處理的骨髓細(xì)胞表面均表達(dá)高水平的DC相對特異性標(biāo)志CD11c。與DC0相比，其余3種DC均以表面共刺激分子和MHC-II分子表達(dá)減少，IL-12 p70分泌下降以及刺激功能減弱為特征，表現(xiàn)出不成熟狀態(tài)。過繼轉(zhuǎn)移這些經(jīng)處理的iDC可使小鼠血糖明顯降低。組織病理檢查發(fā)現(xiàn)胰島內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤減少，組織結(jié)構(gòu)相對完整；過繼耐受性DC的各組胰島β細(xì)胞凋亡情況明顯減輕。
　　 MTT法測

9、定淋巴細(xì)胞增殖能力結(jié)果顯示，受保護(hù)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力明顯下降。FACS測定結(jié)果顯示CD4+CD25+T細(xì)胞亞群比例顯著升高。耐受性DC過繼可有效抑制IL-2和IFN-γ，而提高IL-4和IL-10含量。
　　 結(jié)論：實驗結(jié)果初步證明：
　　 (1)皮下注射自身抗原胰島素可以誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)免疫耐受，促進(jìn)免疫反應(yīng)向Th2型偏離，抑制淋巴細(xì)胞增殖能力并保護(hù)胰島β細(xì)胞免受損傷，最終防止T1D的發(fā)病。
　　 (2)自身抗原

10、胰島素對STZ所致T1D小鼠免疫保護(hù)作用與改善功能異常的DC，并誘導(dǎo)不成熟DC的出現(xiàn)，促進(jìn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化而建立免疫耐受有關(guān)。
　　 (3)體外單獨(dú)采用GM-CSF，或加用IL-4和PHC醇提物，T1D發(fā)病前期小鼠體內(nèi)給予自身抗原胰島素均可以誘導(dǎo)呈現(xiàn)不成熟狀態(tài)的耐受性DC的產(chǎn)生。過繼這些耐受性DC可有效誘導(dǎo)免疫耐受從而保護(hù)小鼠免得T1D，其機(jī)制與促進(jìn)體內(nèi)CD4+CD25+T細(xì)胞亞群產(chǎn)生，重建體內(nèi)Th1/Th2細(xì)