肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶-1在2型糖尿病大鼠肝臟表達的研究.pdf

1、目的:胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病的發(fā)病機制之一。而肝臟是胰島素作用的主要靶器官,維持空腹?fàn)顟B(tài)下的內(nèi)生性葡萄糖的產(chǎn)生和輸出,進食后糖的吸收、利用和存儲。肝臟胰島素抵抗主要是指胰島素抑制肝臟葡萄糖輸出(HGP)能力下降。與胰島素抵抗相關(guān)的非酒精性脂肪性肝損傷(NAFLD)近年來逐漸被國內(nèi)外學(xué)者認識。但它的發(fā)生機制尚不十分清楚。近年來研究表明,在NAFLD發(fā)生機制中氧化應(yīng)激引起的改變起著重要作用。在脂肪儲積的肝臟中氧化應(yīng)激增強,反應(yīng)性氧產(chǎn)

2、物隨NAFLD加重而增多。當(dāng)脂肪細胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生超過超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、維生素E等組成的抗氧化系統(tǒng)的清除能力時,便產(chǎn)生氧應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷,釋放腫瘤壞死因子、白介素-6等炎性細胞因子和遞質(zhì),引起肝細胞發(fā)生氣球樣變和點狀壞死,同時中性粒細胞和淋巴細胞趨化至肝小葉,形成脂肪性肝炎。此外,氧應(yīng)激還可通過形成活性氧,引起肝細胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA變性并積聚,形成Mallory小體,激發(fā)自身免疫性

3、反應(yīng)。肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)是促進長鏈脂肪酸進入線粒體的第一步,并且是脂肪酸β氧化的限速酶,催化脂肪酸轉(zhuǎn)運至線粒體基質(zhì)進行β氧化。本研究在成功復(fù)制2型糖尿病大鼠模型基礎(chǔ)上,用藥物干預(yù),觀察CPT-1在肝臟的表達,實時定量PCR采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,研究CPT-1在胰島素抵抗相關(guān)性肝損傷中的作用,并對NAFLD的發(fā)生機制進行探討。
　　 方法:
　　 1.實驗性大鼠分組及動物模型制備:健

4、康雄性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后,隨機分成正常對照組(10只,普通飼料喂養(yǎng),C組)、模型組(10只,高糖高脂飼料喂養(yǎng)+STZ注射,M組)和阿卡波糖組(10只,高糖高脂飼料喂養(yǎng)+STZ注射,阿卡波糖灌注,A組),自由進食進水,12小時光照周期。模型組和阿卡波糖組大鼠給予高糖高脂喂養(yǎng)4周后,一次性小劑量腹腔注射STZ,正常組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。阿卡波糖組大鼠繼續(xù)給予高糖高脂喂養(yǎng)1周后阿卡波糖灌胃,繼續(xù)喂養(yǎng)4周后處死。<

5、br>　　 2.血清學(xué)測定:處死動物前分別留取各組動物的不抗凝全血4ml,離心,吸取血清約2ml,斷尾采血血糖儀測空腹血糖(FPG),酶比色法測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA),糖基化血紅蛋白(HbA1c)。
　　 3.2型糖尿病大鼠肝臟病理學(xué)改變:取大鼠肝臟組織切片做HE染色。在光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)

6、變化。
　　 4.2型糖尿病大鼠免疫組化檢測:對三組大鼠肝臟標本石蠟切片常規(guī)脫蠟水化,檸檬酸微波修復(fù)法行抗原修復(fù)15 min,3％H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶,抗體稀釋度為1:100,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,以PBS代替一抗設(shè)立陰性對照。CPT-1胞漿棕黃、棕褐色為陽性。采用Im-age-ProPlus6.0軟件進行分析,雙盲法觀察染色切片,每張切片隨機采集10個視野(×200),用平均積分光密度表示陽性物質(zhì)相對含量。
　

7、　 5.糖尿病大鼠肝臟CPT-1基因的表達:(1)肝臟組織RNA的提取:取約100 mg肝臟組織在研缽中加入液氮研磨至粉末狀,加入1 mlTrizol,利用Trizol一步法提取總RNA,經(jīng)分光光度計檢測RAN純度與濃度,OD260/280在1.8～2.0之間的RNA用于合成cDNA。(2)cDNA的合成:取1μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。(3)實時定量PCR:采用熒光染料法,按照試劑盒說明進行操作,擴增目的基因CPT-1,以GAPD

8、H為內(nèi)參。由PCR擴增曲線得到Ct值(域值循環(huán)數(shù)),采用Delta-delta Ct方法進行相對定量。將正常組作為對照組。
　　 6.所有數(shù)據(jù)由SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,計量資料以均數(shù)±標準差表示,兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組大鼠的一般情況、生化指標模型組大鼠的FBG、2hr-PG、TG、ALT、AST、HbA1c均高于對照組(P＜0.05),

9、阿卡波糖組大鼠的FBG、2hr-PG、TG、ALT、AST、HbA1c低于模型組(P＜0.05)。
　　 2.各組大鼠肝臟組織病理改變實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對照組大鼠比較,模型組、阿卡波糖組大鼠肝臟體積明顯增大,顏色呈土黃色,HE染色光鏡下顯示肝細胞漿內(nèi)可見小脂滴形成。阿卡波糖組與模型組比較,肝細胞排列整齊,細胞內(nèi)脂滴含量減少。
　　 3.各組大鼠肝臟CPT-1蛋白表達CPT-1蛋白在對照組大鼠肝組織僅有微量表達。與對照組相

10、比,模型組肝臟組織CPT-1蛋白表達下降(P＜0.05),與模型組相比,阿卡波糖組肝臟組織CPT-1蛋白表達上調(diào)(P＜0.05)。
　　 4.各組大鼠肝臟CPT-1基因mRNA表達與對照組比較,模型組大鼠肝臟組織CPT-1 mRNA表達下降(P＜0.05)。阿卡波糖干預(yù)后,CPT-1mRNA表達上調(diào)(P＜0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.高糖高脂飲食喂養(yǎng)可誘發(fā)制模成功大鼠肝