硫醇轉(zhuǎn)移酶在糖尿病性白內(nèi)障形成中作用的研究.pdf

1、目的：
　　硫醇轉(zhuǎn)移酶(Thioltransferase，TTase)對維持晶狀體氧化還原平衡狀態(tài)有重要作用。本研究通過觀察糖尿病性白內(nèi)障和年齡相關(guān)性白內(nèi)障，及不同類型年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜中 TTase含量與活性，分析其與臨床資料的相關(guān)性，探討硫醇轉(zhuǎn)移酶在糖尿病性白內(nèi)障形成中可能的作用。建立鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)糖尿病大鼠白內(nèi)障的模型，觀察大鼠晶狀體的形態(tài)和相關(guān)生化指標(biāo)改變與TTase變化的關(guān)系，進一步探討 TTase在

2、糖尿病性白內(nèi)障形成中的作用；采用不同濃度和時間高糖處理晶狀體上皮細胞，觀察細胞 TTase表達和活性的變化，研究與細胞生化指標(biāo)和凋亡相關(guān)蛋白的關(guān)系，探討TTase在高糖引起的細胞氧化損傷中可能的作用。
　　方法：
　　1．分別收集行白內(nèi)障超聲乳化術(shù)的糖尿病性白內(nèi)障晶狀體前囊膜108例和年齡相關(guān)性白內(nèi)障108例，分40-55歲，56-65歲，66-80歲三個年齡段，Western blot檢測晶狀體前囊膜 TTase蛋白質(zhì)的含

3、量，TTase活性及谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量；分析糖尿病性白內(nèi)障晶狀體前囊膜TTase活性與患者年齡、病程、視力、血糖、糖化血紅蛋白、GSH等資料的相關(guān)性；分析50-60歲年齡相關(guān)性白內(nèi)障（核性、皮質(zhì)性和混合性白內(nèi)障）晶狀體前囊膜的TTase表達和活性[1]。
　　2．取雄性SD大鼠30只，隨機分為2組，隨機選擇15只為糖尿病組，按65mg/kg的劑量給予注射鏈脲佐菌素（STZ），溶解于0.02 mol

4、/L枸櫞酸鈉緩沖液，對照組給予注射等量枸櫞酸鈉緩沖液。STZ后72小時，血糖濃度達到16.7 mmol/L認為造模成功；定期監(jiān)測各組大鼠體重、血糖，每周用1％濃度復(fù)方托品酰胺眼液散瞳后，在裂隙燈下觀察并記錄其晶狀體混濁程度的變化情況。12周后處死大鼠，取出眼球，分離晶狀體，放-80℃?zhèn)溆谩estern blot檢測兩組大鼠的晶狀體中TTase表達，用試劑檢測其活性的變化。采用DTNB顯色法測量和計算晶狀體中GSH及GSSG的含量。SP

5、SS統(tǒng)計軟件分析TTase與晶狀體混濁程度、GSH、GSSG的關(guān)系。
　　3．將晶狀體上皮細胞（HLE B3）系用不同濃度葡萄糖培養(yǎng)（5.5mM、15.5mM，25.5mM和35.5mM葡萄糖和高滲甘露醇對照組）。高糖刺激細胞24小時后搜集細胞，檢測TTase表達，建立濃度曲線。根據(jù)濃度梯度結(jié)果，選擇35.5mM葡萄糖為實驗濃度處理晶狀體上皮細胞，分別在0h，2h，8h，16h，24h時間點搜集細胞，檢測TTase表達和活性，建立

6、時間曲線。同時檢測0h，2h，8h，16h，24h細胞GSSG和GSH，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Western blot檢測與凋亡相關(guān)的蛋白Bax和Caspase-3的表達。
　　結(jié)果：
　　1．TTase活性在40-55歲組糖尿病晶狀體前囊膜中（2.36±0.78 mU/mg protein）表達高于同齡組年齡相關(guān)性白內(nèi)障組(2.64±0.83 mU/mg protein)（P＜0.05），而在56歲以上組間無顯著性差異；

7、TTase蛋白質(zhì)表達結(jié)果與活性相似；多因素相關(guān)性分析顯示TTase蛋白質(zhì)表達和活性與糖尿病患者的年齡（R=-0.755）、病程（R=-0.515）、糖化血紅蛋白（R=-0.607）、糖尿病視網(wǎng)膜病變的程度（R=-0.438）、GSH（R=0.730）和GSSG（R=-0.438）相關(guān)，與空腹血糖（R=-0.147）、視力（R=0.199）、白內(nèi)障類型（R=-0.134）無關(guān)；不同類型年齡相關(guān)性白內(nèi)障：皮質(zhì)性（2.24±0.87 mU/m

8、g protein）、核性（2.14±0.61 mU/mg protein）和混合性（2.09±0.76 mU/mg protein）白內(nèi)障晶狀體前囊膜中TTase活性無顯著性差異[1]。
　　2．注射STZ后72小時，糖尿病組大鼠血糖較正常對照組顯著增高（P<0.01），并出現(xiàn)多飲、體重下降。散瞳裂隙燈下觀察結(jié)果顯示，STZ注射后第4周，糖尿病大鼠晶狀體逐漸開始發(fā)生混濁，第8周之前晶狀體混濁程度進展比較緩慢，8周以后混濁快速進展

9、。正常組大鼠體重始終保持較高水平，糖尿病大鼠體重較對照組低（P＜0.01），4周以后晶狀體混濁程度明顯重于對照組大鼠（P＜0.05），正常對照組大鼠晶狀體始終保持透明。12周后檢測晶狀體GSH的含量糖尿病組（28.31±4.76 umol/g protein）較對照組（52.97±6.44 umol/g protein）下降了約50%（P＜0.05），GSSG含量（6.94±1.40 umol/g protein）則較對照組（2.03±

10、0.45 umol/g protein）顯著增加（P＜0.05）。Western blot顯示，糖尿病組大鼠晶狀體TTase的表達較對照組顯著降低（P＜0.05），活性（0.81±0.27U/g protein）也明顯低于對照組（1.26±0.29U/g protein）（P＜0.05），且與GSH正相關(guān)（R=0.593，P＜0.05），與晶狀體混濁程度和GSSG呈負相關(guān)（R=-0.541，P＜0.05）。
　　3．TTase蛋白

11、質(zhì)表達隨葡萄糖濃度增加逐漸增強，在35.5 mM葡萄糖組中最強，高滲對照組甘露醇組無明顯變化。TTase活性在35.5 mM葡萄糖處理后2h開始升高（5.41±0.91mU/mg protein），8h達到高峰（9.47±1.22mU/mg protein）較對照組（4.83±0.62mU/mg protein）顯著增高（P<0.05），然后逐漸下降。GSH在加入高糖16h后(7.41±0.92 nmol/mg protein)較對照組

12、（10.33±1.56nmol/mg protein）顯著下降（P<0.05）。而GSSG和GSSG/T-GSH比值隨時間逐漸增加，2h后開始升高分別為0.78±0.082 nmol/mg protein和6.38±0.72%，與對照組比較有顯著性差異（P<0.05），8h后繼續(xù)增加（P<0.05），到24h時GSSG達到1.23±0.15nmol/mg protein，GSSG/T-GSH為12.1±1.49%（P<0.05）。而高糖

13、（35.5 mM）處理晶狀體上皮細胞24h后，與對照組相比細胞凋亡情況不顯著，細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax隨時間表達上調(diào)，Pro-Caspase3表達逐漸下降。
　　結(jié)論：
　　1．晶狀體前囊膜TTase表達與活性在年輕糖尿病患者較年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者增高；TTase活性與糖尿病患者的年齡、病程、糖化血紅蛋白、GSH和GSSG、糖尿病視網(wǎng)膜病變的程度相關(guān)，可能在糖尿病性白內(nèi)障的形成中有重要的保護作用；而不同類型年齡相關(guān)性白內(nèi)障的形

14、成與TTase關(guān)系不明顯[1]。
　　2．腹腔注射STZ可誘導(dǎo)糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯的晶狀體混濁，GSH的含量下降，GSSG增高，同時TTase的表達和活性降低，且與晶狀體的混濁程度和GSH、GSSG的變化相關(guān)，提示TTase協(xié)同參與糖尿病大鼠白內(nèi)障形成中氧化損傷的機制。
　　3．高糖處理晶狀體上皮細胞可誘發(fā)TTase表達快速上調(diào)，并呈濃度依賴性，同時伴GSH的含量下降，GSSG增加，凋亡相關(guān)蛋白表達變化，提示TTase可能參與