MD-2基因啟動(dòng)子區(qū)SNP分析及其與LPS反應(yīng)的關(guān)系.pdf

1、臨床流行病學(xué)資料統(tǒng)計(jì)顯示，膿毒癥是臨床危重患者的重要死亡原因，革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁毒性成分-LPS是導(dǎo)致膿毒癥的主要致病因子之一。既往我們主要針對(duì)LPS受體在膿毒癥發(fā)病機(jī)理中的作用開展了大量探索性研究，現(xiàn)己明確TLR4/CD14/MD-2是機(jī)體識(shí)別LPS的關(guān)鍵模式受體，CD14/TLR4基因多態(tài)性在膿毒癥的易感性及預(yù)后方面發(fā)揮了重要作用。MD-2是LPS激活細(xì)胞的重要參與分子，但該基因多態(tài)性在中國(guó)人群中的分布以及在膿毒癥易感性中的作用尚

2、不清楚。為此，本研究課題用生物信息學(xué)方法篩選出MD-2基因啟動(dòng)子區(qū)可能影響基因表達(dá)的SNP位點(diǎn)，然后以中國(guó)重慶地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，采用RFLP方法對(duì)SNP發(fā)生及分布頻率進(jìn)行檢測(cè)分析，通過(guò)構(gòu)建SNP位點(diǎn)不同等位基因啟動(dòng)子載體，以雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)觀察SNP對(duì)MD-2基因啟動(dòng)子活性的影響，并以定量PCR方法檢測(cè)不同基因型個(gè)體MD-2mRNA表達(dá)水平高低，最后探討了不同等位基因個(gè)體全血對(duì)LPS刺激的反應(yīng)性差異。主要結(jié)果與結(jié)論如下：

3、 1.生物信息學(xué)分析顯示，MD-2基因啟動(dòng)子區(qū)-3000bp內(nèi)有8個(gè)SNP位點(diǎn)，其中-1625C→G，-1064A→G，-475A→T三個(gè)SNP位點(diǎn)堿基變異可以影響MD-2基因啟動(dòng)子區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合活性。 2.對(duì)711名重慶地區(qū)漢族健康人群的SNP調(diào)查分析顯示，MD-2基因啟動(dòng)子區(qū)存在-1625C→G和-1064A→G堿基變異，發(fā)生頻率分別為19.84％和34.71％，均為高頻SNP。未見(jiàn)-475位點(diǎn)A→T堿基變異。

4、3.通過(guò)PCR和定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建了含MD-2基因-1704～+61區(qū)域啟動(dòng)子及-1625G和-1064G啟動(dòng)子質(zhì)粒，化學(xué)發(fā)光結(jié)果顯示，在U937細(xì)胞中，-1625G啟動(dòng)子活性明顯高于-1625C啟動(dòng)子活性，-1064A啟動(dòng)子與-1064G啟動(dòng)子活性無(wú)明顯差異。說(shuō)明-1625C→G堿基變異可增強(qiáng)MD-2基因啟動(dòng)子活性，而-1064A→G堿基變異對(duì)靶基因啟動(dòng)子活性無(wú)明顯影響。 4.定量PCR結(jié)果顯示，-1625GG純合子個(gè)體MD-

5、2mRNA表達(dá)水平顯著高于-1625CC純合子個(gè)體，-1625GC雜合子個(gè)體MD-2mRNA表達(dá)水平也高于-1625CC純合子個(gè)體，進(jìn)一步說(shuō)明了-1625C→G堿基變異可通過(guò)影響基因啟動(dòng)子活性而增強(qiáng)基因表達(dá)。 5.以LPS刺激不同基因型個(gè)體全血，-1625GG基因型個(gè)體TNF-α產(chǎn)生水平最高，CG基因型次之，而CC基因型TNF-α產(chǎn)生水平最低，提示-1625C→G堿基變異能顯著增強(qiáng)個(gè)體-內(nèi)毒素反應(yīng)性。說(shuō)明該SNP對(duì)于臨床膿毒癥易