Aβ-,1-40-對(duì)PC12細(xì)胞突觸素和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是老年人神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。其突出病理特征是腦神經(jīng)細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積與淀粉樣斑塊形成，tau蛋白過(guò)度磷酸化與神經(jīng)原纖維纏結(jié)。近年來(lái)突觸的病理改變?cè)贏D發(fā)病中的作用日益受到重視。有研究表明，突觸喪失是AD癡呆的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(growth-associatedprotein43，GAP-43)和突觸素(synapsin)作為突觸前膜和突觸囊泡的結(jié)構(gòu)成分，均

2、為神經(jīng)出芽反應(yīng)代表性的結(jié)構(gòu)蛋白，檢測(cè)這兩種指標(biāo)，可以較好的反映神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)損傷反應(yīng)的可塑性，即可作為突觸的功能標(biāo)記。 本實(shí)驗(yàn)擬采用這兩種突觸蛋白作為突觸改變的標(biāo)記物，以研究神經(jīng)毒性最常用的細(xì)胞株—PC12細(xì)胞為研究對(duì)象，采用免疫組化方法，觀察Aβ1-40對(duì)PC12細(xì)胞突觸素和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的影響，進(jìn)一步探討AD患者突觸喪失的可能機(jī)制，為AD的預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料與方法將PC12細(xì)胞(由中國(guó)科學(xué)院北京細(xì)胞生物研究

3、所提供)進(jìn)行培養(yǎng)，待鏡下PC12細(xì)胞突起伸展得較好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。將24孔培養(yǎng)板的PC12細(xì)胞隨機(jī)分為兩組。實(shí)驗(yàn)組：每孔中加入含10ug/mlAβ1-40的10％馬血清和5％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基；對(duì)照組：加入含等劑量的生理鹽水的10％馬血清和5％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基；每組設(shè)0h，2h，4h，6h，12h時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)孔。在不同的時(shí)間點(diǎn)，將細(xì)胞用4％多聚甲醛固定，用兔抗GAP-43單克隆抗體和小鼠抗突觸素單克

4、隆抗體檢測(cè)GAP-43和突觸素的表達(dá)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)乙醇脫色，二甲苯透明，鏡下觀察。采用顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度定量分析。每組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。 結(jié)果1.對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在不同時(shí)間點(diǎn)兩種突觸蛋白的表達(dá)對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)突觸素和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白免疫反應(yīng)復(fù)合物的灰度值比較，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。 實(shí)驗(yàn)組于藥物作用4h后兩種免疫反應(yīng)復(fù)合物的灰度值明顯下降，與其他時(shí)間點(diǎn)

5、相比差異有顯著性(P＜0.01)。于給藥12h后突觸素和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白幾乎未見(jiàn)到表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)組兩種免疫反應(yīng)復(fù)合物的灰度值在藥物作用2-12h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯低于同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組，差異有顯著性(P＜0.01)。 2.實(shí)驗(yàn)組0-12h突觸素和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的變化趨勢(shì)：2-4h兩種突觸蛋白表達(dá)曲線下降明顯，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 結(jié)論Aβ可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞突觸素和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)明顯減少，為AD突觸損