突觸生長(zhǎng)相關(guān)蛋白Dbn1在小鼠腦發(fā)育中的表達(dá)及其對(duì)NSCs分化的影響.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育涉及包括神經(jīng)誘導(dǎo)、細(xì)胞周期的調(diào)控、神經(jīng)元特異基因的表達(dá)和神經(jīng)前體細(xì)胞的分化等多個(gè)過(guò)程，而這些過(guò)程又涉及了居多信號(hào)通路以及相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物的相互作用?？偟内厔?shì)是：先由少數(shù)幾個(gè)基因產(chǎn)物發(fā)揮作用，使部分信號(hào)通路活化，活化的信號(hào)通路又導(dǎo)致更多的基因轉(zhuǎn)錄，活化更多的信號(hào)通路；逐漸使不同的細(xì)胞出現(xiàn)基因表達(dá)差異，進(jìn)而出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的差異，最后細(xì)胞建立相對(duì)穩(wěn)定的、可傳遞的、與結(jié)構(gòu)和功能相適應(yīng)的基因表達(dá)模式。為了解腦發(fā)育和腦損失修復(fù)過(guò)程

2、中相關(guān)基因的表達(dá)變化，我室利用基因芯片技術(shù)對(duì)小鼠腦發(fā)育過(guò)程中基因進(jìn)行篩選，獲得了1037條腦發(fā)育相關(guān)基因，Dbnl是在此研究中獲得的與軸突生長(zhǎng)相關(guān)的7個(gè)基因之一。 Dbnl是新發(fā)現(xiàn)的小鼠drebrin基因成員，Shrao T研究證實(shí)Dbnl基因位于13<'＃>染色體中間位置，由660個(gè)氨基酸組成，翻譯后為120Kb大小蛋白，特異性表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)，初步研究表明其可能參與調(diào)節(jié)樹突棘的形成以及神經(jīng)元的遷移。Drebrin是一種與腦發(fā)育

3、密切相關(guān)的蛋白，其特異性表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)，后來(lái)的研究顯示在非神經(jīng)元內(nèi)也存在有drebrin的亞類表達(dá)。目前在哺乳動(dòng)物發(fā)現(xiàn)drebrin有四種亞類，他們都是單一基因通過(guò)不同的mRNA剪接方式形成。生物信息學(xué)分析表明，drebrin有且只有一個(gè)特異的區(qū)域與actin進(jìn)行結(jié)合，這個(gè)區(qū)域位于drebrin的中心，去除這個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，drebrin就不能與F-actin結(jié)合。drebrin通過(guò)與actin結(jié)合調(diào)節(jié)actin細(xì)胞骨架在細(xì)胞內(nèi)的聚合和解聚

4、過(guò)程，進(jìn)而引起細(xì)胞形態(tài)改變，對(duì)細(xì)胞分化遷移以及神經(jīng)元突起的形成起重要的調(diào)節(jié)作用。 樹突形成被認(rèn)為是成熟神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)可塑性最顯著的特性，也是NSCs分化和遷移的重要特征和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。NSCs在分化和遷移過(guò)程中，一個(gè)最主要的形態(tài)學(xué)特征改變便是突起的形成和延長(zhǎng)，分化成熟的神經(jīng)細(xì)胞在到達(dá)遷移終點(diǎn)后，與其周邊的細(xì)胞通過(guò)樹突棘建立突觸(synapse)連接。樹突棘是神經(jīng)元樹突的微小棘狀突起，在腦內(nèi)也是多數(shù)突觸的突觸后成分，其最基本的細(xì)胞骨架

5、結(jié)構(gòu)是F-actin。在樹突棘內(nèi)，多種actin的連接蛋白和調(diào)節(jié)蛋白伴隨著軸突的生長(zhǎng)和樹突的形成而呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，他們?cè)谡{(diào)節(jié)軸突和樹突的形態(tài)學(xué)改變中發(fā)揮了重要的作用。因此，對(duì)細(xì)胞骨架蛋白以及相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的深入研究可能為解釋NSCs分化、遷移等機(jī)制問(wèn)題提供新的理論思路。 基于Dbnl對(duì)神經(jīng)元發(fā)育調(diào)節(jié)和突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用，我們推測(cè)Dbnl影響NSCs分化和遷移，對(duì)NSCs分化后突觸連接的建立也具有促進(jìn)作用，因此，本課題在了解D

6、bnl在小鼠腦發(fā)育和神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)模式和定位的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索Dbnl對(duì)小鼠NSC體外分化的可能影響，以及分化遷移后NSC在形成突觸連接過(guò)程中的作用和可能的機(jī)制。研究結(jié)果簡(jiǎn)要如下： (1)以western blot和免疫組化等方法，了解Dbnl在小鼠腦發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式和定位，結(jié)果顯示，在小鼠腦發(fā)育的不同階段，均有Dbnl蛋白的表達(dá)，其中在胚胎后期，Dbnl的表達(dá)達(dá)到高峰，隨后下降，出生以后表達(dá)再次上調(diào)，在出生7d

7、時(shí)最高，隨后又下降，成年以后Dbnl呈低水平表達(dá)表達(dá)；在腦內(nèi)：Dbnl主要表達(dá)在海馬，室管膜，皮層等神經(jīng)元和神經(jīng)干細(xì)胞分布密集的區(qū)域；而Dbnl在細(xì)胞內(nèi)的定位也有一定的時(shí)空模式，表現(xiàn)在胚胎時(shí)，Dbnl彌散分布在細(xì)胞的周邊，而出生以后Dbnl主要分布在細(xì)胞的突起。這些結(jié)果提示Dbnl不但在腦發(fā)育發(fā)育過(guò)程中調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)生以及突觸的形成，而且可能對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的分化和遷移也具有一定影響。 (2)以western blot，real-t

8、ime PCR等方法，了解在NSCs分化過(guò)程中，Dbnl的表達(dá)變化模式，結(jié)果顯示，在NSCs分化過(guò)程中，Dbnl有不同程度的表達(dá)，其mRNA和蛋白表達(dá)的高峰在細(xì)胞分化的第3d時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)，Dbnl主要分布在細(xì)胞的突起；免疫熒光雙標(biāo)顯示，Dbnl與細(xì)胞內(nèi)的actin蛋白有明顯在共聚現(xiàn)象。這些結(jié)果提示：Dbnl可能調(diào)節(jié)NSCs的分化，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞突起的形成具有一定的促進(jìn)作用。 (3)從出生1d的小鼠腦內(nèi)擴(kuò)增出Dbnl的全長(zhǎng)基因，進(jìn)而

9、構(gòu)建了EGFP-Dbnl真核表達(dá)載體，以電轉(zhuǎn)法將構(gòu)建的載體成功導(dǎo)入體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，在無(wú)其他因子作用下，過(guò)表達(dá)Dbnl的神經(jīng)干細(xì)胞能正常分化，通過(guò)免疫熒光染色，了解過(guò)表達(dá)Dbnl后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)actin、突觸后致密蛋白PSD-95和突觸蛋白Synapsinl的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染Dbnl以后，actin和synapsinl的表達(dá)無(wú)明顯影響，而PDS-95表達(dá)水平增加，但PSD-95與Dbnl表達(dá)并不完全的共聚。結(jié)果提示在NSC

10、s分化過(guò)程中，Dbnl與其結(jié)合的細(xì)胞骨架蛋白actin之間并無(wú)表達(dá)依賴關(guān)系，但能夠調(diào)節(jié)突觸相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，因此我們推測(cè)，Dbnl可能通過(guò)影響actin在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)形式，進(jìn)而影響突觸相關(guān)蛋白在樹突的表達(dá)水平。 (4)根據(jù)Dbnl的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)和構(gòu)建了Dbnl mRNA干擾載體，以病毒包裝的方式干擾體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞。觀察了在沉默細(xì)胞內(nèi)源性Dbnl以后，細(xì)胞的分化狀態(tài)和相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾Db