酒精對(duì)PC12細(xì)胞凋亡及神經(jīng)鞘磷脂循環(huán)的影響.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)建立酒精誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡模型，應(yīng)用此模型觀察PC12細(xì)胞凋亡過程中神經(jīng)鞘磷脂循環(huán)相關(guān)酶活性及mRNA表達(dá)量的改變，分析該循環(huán)在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用，為進(jìn)一步研究神經(jīng)細(xì)胞的凋亡機(jī)制提供依據(jù)。
　　 方法：MTT法測(cè)定酒精對(duì)PC12細(xì)胞增殖的抑制作用；Hoechst33258染色熒光顯微鏡觀察PC12細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化；DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡梯狀DNA條帶；RT-PCR法檢測(cè)酒精對(duì)PC12細(xì)胞SMS1、SM

2、S2和N-SMasemRNA表達(dá)的影響；薄層層析方法測(cè)定SMS的活性；熒光分光光度法檢測(cè)N-SMase的活性。
　　 結(jié)果：MTT法結(jié)果顯示，去血清培養(yǎng)的PC12細(xì)胞24h，酒精濃度在100mmol/L、200mmol/L、400mmol/L和800mmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率分別是單純?nèi)パ宓?7.54％、70.73％、57.89％和51.70％，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制作用，與去血清對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)，呈濃度依

3、賴性。含10％胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)組，酒精濃度達(dá)到200mmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用不明顯，與正常培養(yǎng)組相比無顯著性差異(P＞0.05)。Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示，不同濃度的酒精作用PC12細(xì)胞24h，酒精處理組凋亡細(xì)胞增多，表現(xiàn)染色質(zhì)凝集，細(xì)胞核變小、核碎裂成碎片等典型細(xì)胞凋亡特征性變化，凋亡率隨著酒精濃度的增大而升高，去血清組的酒精濃度為100mmoL/L、200mmoL/L和300mmoL

4、/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率分別是19.21±3.2％(P＜0.05)、28.39±5.11％(P＜0.05)和38.68±4.28％(P＜0.01)，呈劑量依賴關(guān)系。瓊脂糖凝膠電泳可見100-300mmoL/L濃度酒精處理組有不同程度的DNA斷裂，顯示凋亡細(xì)胞典型的梯狀DNA。RT-PCR檢測(cè)酒精對(duì)PC12細(xì)胞SMS和N-SMase基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，不同濃度酒精作用于PC12細(xì)胞0.5h，SMS1表達(dá)量無顯著變化，當(dāng)作用時(shí)間達(dá)

5、1h和2h，SMS1表達(dá)量顯著增加，并呈劑量依賴性，而SMS2的mRNA表達(dá)則不受酒精作用的影響；不同濃度酒精作用PC12細(xì)胞0.5h和1h，N-SMase表達(dá)量無顯著變化，作用2h時(shí)表達(dá)升高。以NBD-神經(jīng)酰胺為底物，用薄層層析法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總SMS活性，顯示不同濃度酒精作用PC12細(xì)胞2h，SMS活性隨酒精濃度增加而升高。熒光分光光度法檢測(cè)N-SMase的活性，顯示酒精作用PC12細(xì)胞0.5h時(shí)N-SMase活性變化不顯著(P＞0.0