乙型肝炎病毒介導(dǎo)載脂蛋白和NQO1對(duì)肝細(xì)胞脂肪化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)導(dǎo)致急慢性乙型肝炎,并與肝硬化和肝細(xì)胞癌(Hepatocelluar carcinoma,HCC)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來由于脂肪性肝病(Fatty liver disease,FLD)的發(fā)病率逐年增加,導(dǎo)致脂肪肝與慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)合并存在的病例明顯增多,對(duì)兩者相關(guān)性的研究逐漸受到重視。但是迄今為止,HBV與脂肪肝的關(guān)系尚未完全闡明

2、。本課題組先前通過蛋白質(zhì)組學(xué)和MALDI-TOF/TOFMS技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)HBV影響肝細(xì)胞載脂蛋白(Apolipoprotein,Apo)的表達(dá),并降低NAD(P)H醌氧化還原酶1(NAD(P)H dehydrogenase:quinone 1,NQO1)的表達(dá),現(xiàn)有研究表明上述因子參與脂肪酸的合成和代謝,對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝動(dòng)態(tài)循環(huán)平衡的維持起著重要的作用。本研究在此基礎(chǔ)上,探討HBV編碼蛋白(LHBs、MHBs、HBs、HBc、HBe、HB

3、pol、HBx)與特定宿主細(xì)胞中載脂蛋白表達(dá)的對(duì)應(yīng)關(guān)系,進(jìn)一步探討HBV影響NQO1致肝細(xì)胞脂肪化的機(jī)制,有助于更深入了解HBV的致病機(jī)制,為有效地進(jìn)行脂肪肝的防治提供理論基礎(chǔ)。
　　本研究第一部分旨在探討HBV整體水平對(duì)Apo基因的影響。通過對(duì)HBV細(xì)胞株和pRep-HBV質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HBsAg及HBeAg的檢測(cè),確定HBV基因組的正常復(fù)制和表達(dá);通過realtime RT-PCR的方法,檢測(cè)了16種Apo基因在HepG2

4、.2.15及HepG2細(xì)胞中表達(dá)的差異,并進(jìn)一步用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法在Huh7、HepG2和Hep3B細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明ApoAI,ApoAII,ApoAV,ApoB,ApoCIII,ApoE,ApoF,ApoH,ApoJ,ApoL1和ApoM和對(duì)照組相比轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低,APOD的轉(zhuǎn)錄水平和對(duì)照組相比明顯升高;通過檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)HBV表達(dá)量對(duì)上述Apo基因轉(zhuǎn)錄水平的影響,證實(shí)HBV表達(dá)量對(duì)Apo基因的表達(dá)影響具有時(shí)間效應(yīng)。
　

5、　本研究第二部分應(yīng)用Ad Easy XL System構(gòu)建HBV七種編碼蛋白的重組腺病毒表達(dá)載體Ad-LHBs、Ad-MHBs、Ad-HBs、Ad-HBc、Ad-HBe、Ad-HBpol、Ad-HBx及對(duì)照空病毒Ad-GFP,探討HBV編碼蛋白對(duì)特定宿主細(xì)胞中Apo基因表達(dá)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。通過對(duì)腺病毒包裝過程的監(jiān)測(cè)和Western blot檢測(cè),成功構(gòu)建可分別表達(dá)HBVLS、MS、S、Core、E、Pol、X蛋白的重組腺病毒;通過real

6、time RT-PCR檢測(cè)HBV七種編碼蛋白對(duì)Apo基因的表達(dá)影響,我們發(fā)現(xiàn)HBs下調(diào)ApoAII的轉(zhuǎn)錄水平,MHBs下調(diào)ApoF的轉(zhuǎn)錄水平,HBpol下調(diào)ApoH的轉(zhuǎn)錄水平,且均與HBV整體水平結(jié)果一致;通過western blot進(jìn)一步檢測(cè)ApoAII、ApoF和ApoH基因蛋白水平的變化,發(fā)現(xiàn)HBs下調(diào)ApoAII蛋白水平,與轉(zhuǎn)錄水平一致;MHBs和HBpol分別上調(diào)ApoF和ApoH的蛋白水平,與轉(zhuǎn)錄水平不一致,我們考慮可能存在

7、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯和翻譯后水平的多種組合調(diào)控,具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。
　　本研究第三部分旨在探討HBV特別是HBx抑制NQO1致肝細(xì)胞脂肪化的機(jī)制。通過對(duì)活細(xì)胞內(nèi)源性ROS和超氧化物的檢測(cè),證實(shí)HBx通過抑制NQO1的表達(dá)從而誘發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激;通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶還原性谷胱甘肽GSH的檢測(cè),表明過量的ROS產(chǎn)生可能會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御體系;應(yīng)用Annexin-V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,證實(shí)過量的ROS蓄積引起