溶血磷脂酸受體3和環(huán)氧合酶2及子宮內(nèi)膜胞飲突與小鼠子宮內(nèi)膜容受性的相關(guān)研究.pdf

1、胚胎植入是妊娠成功的關(guān)鍵因素之一，子宮內(nèi)膜容受性的建立是胚胎成功植入的決定因素。因此對(duì)子宮內(nèi)膜胚胎容受性的研究顯得尤為重要。子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜在卵巢甾體激素調(diào)節(jié)下，子宮內(nèi)膜形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)和分泌蛋白等發(fā)生一序列變化，使子宮內(nèi)膜處于一種允許囊胚定位、黏附、侵入并使內(nèi)膜間質(zhì)發(fā)生改變從而導(dǎo)致胚胎著床的狀態(tài)。這個(gè)特定的時(shí)期稱為“著床窗期”。此時(shí)子宮內(nèi)膜和胚胎相互作用，在非常短的著床窗期共同完成著床過(guò)程。在此前后，子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎處于不容受階

2、段。在這一過(guò)程中，眾多因素包括類固醇激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子信號(hào)以及黏附分子等，他們?cè)诓煌臅r(shí)間和空間環(huán)境控制下表達(dá)并發(fā)揮作用，共同構(gòu)成了支持胚胎成功植入的分子基礎(chǔ)。任何一個(gè)或幾個(gè)因素表達(dá)水平出現(xiàn)異常，都有可能導(dǎo)致內(nèi)膜環(huán)境發(fā)生改變，影響子宮內(nèi)膜容受性，從而導(dǎo)致不孕。目前，子宮內(nèi)膜容受性建立的確切機(jī)制尚不甚清楚，這對(duì)提高助孕技術(shù)水平和調(diào)節(jié)生育方法的發(fā)展是極大的障礙，進(jìn)一步了解參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的信號(hào)途徑，將有助于更好地理解胚胎種植失敗

3、的原因，從而提高臨床妊娠率。
　　 溶血磷脂酸（LPA）是Mills等在卵巢癌腹水中發(fā)現(xiàn)的一種新的生長(zhǎng)因子，為細(xì)胞膜脂類衍生物，是細(xì)胞間磷脂類信號(hào)分子。存在于血清、眼房水和血漿等多種體液中，主要由活化的血小板、成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞以及癌細(xì)胞分泌，也可由某些炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生。LPA主要通過(guò)與靶細(xì)胞上特異G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，發(fā)揮多種生物學(xué)功能：包括細(xì)胞的生存、增殖、分化、細(xì)胞骨架的重排、細(xì)胞間的相互作用以及腫瘤的形成和侵襲等

4、。LPA受體主要有四種（LPARl）LPARl-4，屬內(nèi)皮分化基因家族。LPAR1、LPAR2在機(jī)體內(nèi)廣泛存在，而LPAR3主要表達(dá)于卵巢、心臟、睪丸、前列腺等組織。最近研究發(fā)現(xiàn)，LPAR1、LPAR2主要參與小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、顱面的形成，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)；LPAR3則主要與雌性生殖系統(tǒng)有關(guān)。敲除LPAR3基因的雌性小鼠，表現(xiàn)為胚胎種植延遲、分布空間異常、子宮內(nèi)膜環(huán)氧合酶-2（COX-2）、前列腺素E2（PGE2）、前列腺素12

5、（PGI2）表達(dá)降低。COX-2是合成前列腺素的限速酶。對(duì)該基因缺失小鼠若給予外源性PGE2和PGI2類似物一前列環(huán)素（cPGI），可有效改善LPAR3基因缺失所致的胚胎種植延遲，提示LPA可能通過(guò)LPAR3-COX2-PGS下游信號(hào)途徑調(diào)節(jié)胚胎種植。目前對(duì)LPAR3研究較多的是其在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用。最新研究表明，卵巢癌高表達(dá)LPA及其受體LPAR2～3，可刺激腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、粘附、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）活化和血管生成因子

6、的分泌，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。胚胎著床過(guò)程與腫瘤細(xì)胞的侵襲過(guò)程有一定的相似之處。目前對(duì)LPAR3在子宮內(nèi)膜容受性的建立和胚胎著床方面的研究甚少。
　　 胞飲突是掃描電鏡下所見(jiàn)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞膜頂端出現(xiàn)的大而平滑的膜狀突起。在嚙齒類動(dòng)物，它的出現(xiàn)與子宮內(nèi)膜著床窗完全一致。在人類正常月經(jīng)周期，它出現(xiàn)在月經(jīng)中期LH峰的第6～8d，正是囊胚開(kāi)始與子宮內(nèi)膜粘附的時(shí)期。因此，胞飲突被認(rèn)為是代表子宮內(nèi)膜容受性的特異性形態(tài)學(xué)標(biāo)記物。發(fā)育完全

7、的胞飲突只存在24小時(shí)，代表了暫時(shí)性的細(xì)胞狀態(tài)。目前有關(guān)胞飲突調(diào)節(jié)生殖作用的研究較多，但與LPAR3間關(guān)系的研究，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 控制性超促排卵（COH）是決定體外受精-胚胎移植技術(shù)（IVF-ET）成功與否的重要環(huán)節(jié)。在此過(guò)程中，為了獲得多個(gè)同步發(fā)育的成熟卵子，常應(yīng)用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa）和促排卵藥物。目前臨床上最常用GnRHa長(zhǎng)方案超促排卵。大量研究顯示，該方案能有效改善卵子質(zhì)量，提高卵子回收率，受精

8、率及優(yōu)質(zhì)胚胎率，但胚胎種植率和臨床妊娠率仍較低。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，這可能與GnRHa長(zhǎng)方案超排卵后，干擾了內(nèi)源性激素的平衡，影響了子宮內(nèi)膜形態(tài)及分泌功能，使內(nèi)膜發(fā)育與胚胎發(fā)育不同步，從而降低了子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)。但COH影響子宮內(nèi)膜容受性的確切機(jī)制還不清楚。因此，探討子宮內(nèi)膜容受性降低的機(jī)制并尋找有效的拮抗方法，對(duì)提高IVF-ET的臨床妊娠率將有著重要意義。目前GnRHa長(zhǎng)方案促排卵對(duì)子宮內(nèi)膜LPAR3及胞飲突時(shí)空上共同影響的研究，國(guó)內(nèi)外未

9、見(jiàn)報(bào)道。
　　 因此，研究LPAR3、COX-2在小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)、作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制以及與胞飲突的關(guān)系，可能會(huì)為探討子宮內(nèi)膜容受性的建立，揭示COH影響子宮內(nèi)膜容受性的分子機(jī)制，提供理論依據(jù)。
　　 受人類臨床取材的制約，本研究選用昆明小鼠作為研究對(duì)象，因小鼠和人類同屬哺乳動(dòng)物，著床過(guò)程類似。
　　 第一部分溶血磷脂酸受體3和環(huán)氧合酶-2在小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜的表達(dá)及胞飲突發(fā)育的研究
　　 目

10、的：探討溶血磷脂酸受體3（LPAR3）mRNA及其蛋白，環(huán)氧合酶（COX-2）在小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜的表達(dá)以及胞飲突的發(fā)育變化。
　　 方法：采用半定量RT-PCR和Western blotting法以及免疫組織化學(xué)SP法，檢測(cè)真孕組和假孕組小鼠LPAR3 mRNA及其蛋白在圍著床期子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)規(guī)律。應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)COX-2蛋白在子宮內(nèi)膜的表達(dá)。掃描電子顯微鏡觀察小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜胞飲突的發(fā)育。
　　

11、 結(jié)論：LPAR3、COX-2和胞飲突可能參與了胚胎的著床及子宮內(nèi)膜容受性的建立過(guò)程。LPAR3和子宮內(nèi)膜的超微結(jié)構(gòu).胞飲突，表達(dá)時(shí)序一致，可作為判斷子宮內(nèi)膜具有容受性的分子參考指標(biāo)。LPAR3和胞飲突的變化與宮腔內(nèi)是否有胚胎存在無(wú)顯著相關(guān)性，說(shuō)明主要受母體信號(hào)的調(diào)節(jié)。COX-2可能參與胚胎植入過(guò)程。
　　 第二部分雌孕激素對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜及Ishikawa細(xì)胞LPAR3表達(dá)的影響
　　 目的：探討雌、孕激素和孕激素拮抗劑

12、米非司酮（RU486）對(duì)去勢(shì)雌性小鼠在體子宮內(nèi)膜及體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞株Ishikawa細(xì)胞LPAR3 mRNA及其蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：建立去勢(shì)雌性昆明小鼠動(dòng)物模型，隨機(jī)分為雌激素組，孕激素組，雌孕激素聯(lián)合組以及孕激素+RU486組，應(yīng)用半定量RT-PCR、Western blotting法，檢測(cè)子宮內(nèi)膜LPAR3 mRNA及其蛋白的表達(dá)。體外培養(yǎng)高分化子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞Ishikawa細(xì)胞，分別加入不同濃度17-

13、β雌二醇（10-9M，10-8M，10-7M）、孕激素（10-7M，10-6M，10-5M），雌+孕激素（10-8M+10-6M）。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)給藥刺激48 h后LPAR3蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：孕激素單獨(dú)作用，顯著提高小鼠子宮內(nèi)膜LPAR3 mRNA及其蛋白的表達(dá)，呈時(shí)間依賴性，無(wú)明顯量效關(guān)系；雌激素單獨(dú)作用對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜LPAR3表達(dá)無(wú)明顯影響；雌、孕激素聯(lián)合作用，雌激素降低孕激素對(duì)LPAR3表達(dá)

14、上調(diào)作用；RU486減弱孕激素的表達(dá)上調(diào)作用。雌、孕激素對(duì)Ishikawa細(xì)胞，LPAR3蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響。
　　 第三部分 GnRHa長(zhǎng)方案促排卵對(duì)圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜LPAR3的表達(dá)及胞飲突發(fā)育的影響
　　 目的：研究GnRHa/HMG/HCG控制性超促排卵（COH）對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜LPAR3 mRNA及其蛋白表達(dá)的影響以及胞飲突發(fā)育的變化。探討COH長(zhǎng)方案促排卵影響子宮內(nèi)膜容受性的可能分子機(jī)制，為臨床改善促排卵方

15、案提供理論依據(jù)。
　　 方法：將雌性健康未孕昆明系小鼠隨機(jī)分為COH組和自然受孕組（NC），用半定量RT-PCR、Western blotting方法，檢測(cè)3 d.p.c～6d.p.c子宮內(nèi)膜LPAR3 mRNA及其蛋白的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用掃描電子顯微鏡觀察子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育情況。全自動(dòng)免疫測(cè)定儀檢測(cè)小鼠血清雌、孕激素水平。
　　 結(jié)論：COH影響小鼠內(nèi)源性激素的平衡，使雌、孕激素異常升高?？赡芡ㄟ^(guò)改變與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的