表皮生長因子受體對哮喘小鼠氣道重塑的影響及機制.pdf

1、支氣管哮喘(bronchial asthma)是氣道的慢性變應(yīng)性炎癥,氣道內(nèi)和氣道壁浸潤的炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等釋放出多種細(xì)胞毒性蛋白和炎癥細(xì)胞因子,導(dǎo)致氣道上皮損傷而激活修復(fù)反應(yīng),這種損傷與修復(fù)的反復(fù)交替最終導(dǎo)致了氣道重塑。氣道重塑是哮喘的特征性病理改變之一,是氣道阻塞癥狀由可逆性發(fā)展成為不可逆性的基礎(chǔ),也是氣道高反應(yīng)性持續(xù)存在的基礎(chǔ)。氣道重塑的發(fā)生機制較為復(fù)雜,至今仍未完全清楚。
　　 表皮生長因子受體(epid

2、ermal growth factor receptor,EGFR)是一種廣泛分布于人體組織細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶。其配體包括表皮生長因子(epidermalgrowth factor,EGF)、肝素結(jié)合性表皮生長因子(heparin-binding epidermal growthfactor-like growth factor,HB-EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(transforming growth factoraloha,TG

3、F-α)及雙調(diào)蛋白(amphiregulin,AR)等,其中HB-EGF是多種細(xì)胞的促有絲分裂原,如氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等,可促進這些細(xì)胞的分裂、增殖和遷移；TGF-α可使黏蛋白在核酸和蛋白水平明顯增高,杯狀細(xì)胞超常增生,導(dǎo)致氣道黏液過度分泌和黏液栓的形成,是引起哮喘氣道梗阻和窒息的主要因為之一,提高了哮喘的發(fā)病率和死亡率。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(AG1478)對EGFR具有高度選擇性,通過阻

4、斷EGFR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,使多種效應(yīng)細(xì)胞(如氣道上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞等)的增殖受到抑制,并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。
　　 目的
　　 本實驗通過建立哮喘小鼠模型,探討EGFR、HB-EGF、TGF-α在哮喘發(fā)病機制中的作用以及應(yīng)用AG1478觀察其對哮喘氣道重塑的干預(yù)作用以及EGFR、HB-EGF、TGF-α表達(dá)的影響,為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法
　　 1對象和模型制備方法<

5、br>　　 健康清潔級BALB/c小鼠32只,雄性,6-8周齡,體重(15+2)g,按隨機數(shù)字法分為四組:對照組、哮喘組、AG1478組、地塞米松組,每組8只。制備方法:哮喘組、AG1478組、地塞米松組小鼠分別在第1天、第8天、第15天腹腔內(nèi)注射抗原混合液0.2 ml(含氫氧化鋁1mg和卵蛋白20μg)致敏,第22天開始霧化吸入1％卵蛋白激發(fā),隔日一次,每次30min,持續(xù)至第35天,共計7次。AG1478組和地塞米松組每次激發(fā)前1

6、h分別給予腹腔內(nèi)注射AG1478(15mg/kg)和地塞米松(10mg/kg)。對照組小鼠的腹腔內(nèi)注射和霧化吸入均用生理鹽水代替,次數(shù)同前。
　　 2標(biāo)本采集
　　 各組小鼠于末次霧化結(jié)束后24h內(nèi)用戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔內(nèi)注射進行麻醉,迅速開胸結(jié)扎左肺門,取下左肺,置于液氮凍存,留作RT-PCR用；右肺生理鹽水沖洗后取中葉,置于10％多聚甲醛溶液固定24h,石蠟包埋,選取垂直、平行氣道取材,做厚度5μm切片,分別

7、做Masson染色、PAS染色和免疫組織化學(xué)染色。
　　 3 EGFR、HB-EGF、TGF-α表達(dá)水平的測定
　　 3.1免疫組化、Masson染色和PAS染色切片
　　 應(yīng)用計算機圖像分析系統(tǒng),在高倍鏡(x400)下每張切片隨機選取5個具有代表性的視野,分別選取陽性區(qū)域,免疫組化和Masson染色測量其密度值,PAS染色統(tǒng)計杯狀細(xì)胞數(shù)量,計算平均值為最后的測定結(jié)果。
　　 3.2 RT-PCR

8、　　 應(yīng)用凝膠分析軟件Band Scan5.0分別比較EGFR、HB-EGF與β-actin的相對A值并進行半定量分析。
　　 4統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,各組樣本均數(shù)經(jīng)過方差齊性檢驗后,采用單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD-t檢驗；兩變量的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

9、>　　 結(jié)果：
　　 1動物一般情況觀察
　　 哮喘組經(jīng)過卵蛋白反復(fù)激發(fā)后,出現(xiàn)易激惹、煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、兩便失禁等癥狀。AG1478組和地塞米松組也出現(xiàn)了哮喘組相似癥狀,但程度明顯較輕。對照組無明顯異常反應(yīng)。
　　 2病理形態(tài)學(xué)觀察
　　 普通光鏡下(x200)觀察,哮喘組小鼠氣道壁增厚,管腔狹窄,氣道上皮受損、脫落,上皮下膠原沉積明顯,杯狀細(xì)胞數(shù)量增加,黏液分泌增多,氣道周圍有大量炎性細(xì)

10、胞浸潤。AG1478組和地塞米松組的改變與哮喘組相似,但程度明顯較輕。對照組未見明顯的病理形態(tài)學(xué)改變。
　　 3肺組織HB-EGF和TGF-α蛋白的表達(dá)
　　 在小鼠肺內(nèi)HB-EGF主要表達(dá)于氣管黏膜上皮細(xì)胞,TGF-α主要表達(dá)于氣管黏膜上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞。HB-EGF、TGF-α在哮喘組的表達(dá)(0.587±0.110和0.585±0.078)顯著高于對照組(0.196±0.052和0.241±0.

11、062),P<0.05；AG1478組表達(dá)量(0.330±0.080和0.345±0.072)和地塞米松組表達(dá)量(0.372±0.073和0.384±0.054),明顯低于哮喘組,P<0.05。
　　 4肺組織中EGFR和HB-EGF mRNA的表達(dá)
　　 應(yīng)用RT-PCR檢測顯示,哮喘組EGFR和HB-EGF mRNA表達(dá)量(0.720±0.120和0.616±0.108),明顯高于對照組(0.229±0.076和0.

12、191±0.067),P<0.05；AG1478組表達(dá)量(0.418±0.093和0.340±0.096)和地塞米松組表達(dá)量(0.446±0.010和0.391±0.101),較哮喘組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 5平均膠原沉積面積和平均杯狀細(xì)胞數(shù)
　　 哮喘組小鼠上皮下膠原沉積面積和杯狀細(xì)胞數(shù)(6.822±0.954和17.062±1.328)顯著高于對照組(2.806±0.466和9.388±0

13、.938),P<0.05；AG1478組(4.007±0.805和13.025±0.956)和地塞米松組(4.206±0.832和13.412±0.904),明顯低于哮喘組,P<0.05。
　　 6相關(guān)性分析
　　 哮喘組EGFR與膠原沉積面積和杯狀細(xì)胞數(shù)的相關(guān)系數(shù)γ分別為0.699和0.522,P<0.01,說明EGFR與兩者呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.EGFR及其配體HB-EGF和TGF-α可