早期多次卡介苗接種對哮喘小鼠氣道重塑的影響及相關(guān)免疫機(jī)制研究.pdf

1、支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種以嗜酸性粒細(xì)胞（Eosinophils，Eos）、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞浸潤為主的氣道慢性炎癥性疾病，表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性和可逆性氣流受限。氣道炎癥的反復(fù)發(fā)生或持續(xù)存在會使氣道出現(xiàn)不可逆的結(jié)構(gòu)改變，稱為氣道重塑，其特征主要有：氣道周圍平滑肌增生/肥大，上皮下纖維化和膠原沉積，上皮細(xì)胞黏液化生和黏液高分泌以及微血管的增生。當(dāng)哮喘發(fā)展至氣道重塑階段會出現(xiàn)氣流受限的不完全可逆，患者對抗炎治療的反應(yīng)下降而使預(yù)后交差。

2、r>　　 哮喘嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)有增高趨勢。目前全球有超過3億哮喘患者，我國約有3900萬哮喘患者?，F(xiàn)行的以吸入糖皮質(zhì)激素為首選的治療方案能控制哮喘癥狀，但需長期用藥，不能預(yù)防及根治其發(fā)生，也不能抑制氣道重塑的發(fā)生。如何從哮喘的發(fā)病機(jī)制入手尋找一有效的哮喘預(yù)防手段是目前面臨的難題。
　　 現(xiàn)有研究表明哮喘是一種免疫失衡性疾病，哮喘的發(fā)生與機(jī)體IFN-γ的微環(huán)境缺失和Th2細(xì)胞免疫的過度存在相關(guān)，大量Th2

3、細(xì)胞因子（IL-4，IL-5，IL-13等）的增加，促進(jìn)了IgE的釋放，致使肺組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和氣道黏液高分泌，導(dǎo)致氣道反應(yīng)性的增高和氣道重塑的發(fā)生。通過糾正機(jī)體失衡的Thl/Th2免疫反應(yīng)成為預(yù)防哮喘研究的熱點(diǎn)和靶點(diǎn)。
　　 減毒活菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)是一種很強(qiáng)的Thl免疫刺激劑，多項(xiàng)動物研究顯示，BCG干預(yù)可明顯抑制抗原致敏激發(fā)所致的氣道Eos浸潤，降低氣道高反應(yīng)性。流行病

4、學(xué)研究關(guān)于人體BCG接種與哮喘發(fā)生的關(guān)系雖然有爭議，但是最近一項(xiàng)對23項(xiàng)臨床研究的薈萃分析結(jié)果表明，人類生命早期接種BCG疫苗能夠降低兒童哮喘發(fā)生率，進(jìn)一步支持了BCG接種能夠預(yù)防哮喘發(fā)生的觀點(diǎn)。
　　 BCG接種對哮喘的抑制作用與多種因素有關(guān)，包括BCG結(jié)構(gòu)重組，采用不同的接種途徑、接種次數(shù)以及改變接種時(shí)間窗等。多年來我們實(shí)驗(yàn)室致力于尋求一種最有效的、安全的、有望應(yīng)用于人類的接種方式。通過一系列的前期研究，我們發(fā)現(xiàn)新生兒期幼鼠

5、多次皮下給予小劑量BCG接種可以抑制成年后哮喘的發(fā)生，并且該保護(hù)作用能維持至老年。既然BCG早期多次接種能長期抑制哮喘氣道炎癥，那么是否可以進(jìn)一步抑制與炎癥持續(xù)存在相關(guān)的氣道重塑的發(fā)生呢？目前為止，有關(guān)早期多次BCG接種對哮喘氣道重塑的影響尚未見報(bào)道。
　　 其次是關(guān)于BCG接種抑制哮喘發(fā)生的免疫機(jī)制問題。雖然多數(shù)研究均證實(shí)BCG是一很強(qiáng)的Thl免疫刺激劑，但隨著調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）和新

6、型Th細(xì)胞（Thl7細(xì)胞）的發(fā)現(xiàn)以及功能的不斷研究，BCG是否通過Treg或Thl7來抑制哮喘發(fā)生也受到重視。有研究發(fā)現(xiàn)IL-17能夠促進(jìn)機(jī)體對結(jié)核桿菌最佳的Thl免疫反應(yīng)，介導(dǎo)T細(xì)胞分泌IFN-γ，并促進(jìn)表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞向肺內(nèi)遷移，從而在結(jié)核桿菌疫苗干預(yù)哮喘的過程中發(fā)揮作用。也有研究認(rèn)為結(jié)核桿菌疫苗能夠通過誘導(dǎo)Treg增殖抑制哮喘炎癥。但以上研究多基于急性炎癥模型或體外研究。而現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，慢性或重癥哮喘與急性或輕癥哮喘

7、患者中多種炎癥因子的表達(dá)存在明顯差異，如在慢性持續(xù)性或重癥哮喘患者中Thl7細(xì)胞比例和IL-17的表達(dá)明顯高于輕癥患者?；诒狙芯恐形覀兪褂玫氖锹詺獾乐厮苣Ｐ?，我們有興趣觀察BCG早期接種在慢性哮喘中的免疫調(diào)節(jié)模式，而這方面目前鮮見報(bào)道。
　　 由此，本實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行研究：（1）通過構(gòu)建小鼠哮喘氣道重塑模型，觀察新生期多次BCG接種對小鼠哮喘氣道重塑發(fā)生的影響；（2）通過流式細(xì)胞術(shù)和real-time PCR檢測早期多次BC

8、G接種后肺組織T細(xì)胞亞群的變化，從而了解早期多次皮下接種BCG在氣道重塑模型中的免疫應(yīng)答情況。
　　 第一部分：小鼠哮喘氣道重塑模型的建立及早期多次卡介苗接種對氣道重塑的影響
　　 目的：通過抗原致敏和反復(fù)激發(fā)建立具有典型氣道重塑特征的慢性哮喘模型。觀察早期多次卡介苗接種對哮喘氣道重塑的影響。
　　 方法：采用BALB/c新生鼠，分為OVA致敏激發(fā)組（OVA組）、早期多次BCG接種組（BCG+OVA組）和生理鹽水

9、陰性對照組（SHAM組）。BCG+OVA組小鼠分別在出生O、7、14天予以BCG105CFUs的劑量行皮下接種3次，OVA組和SHAM組注射等體積注射用水。小鼠長大至5周時(shí)予OVA腹腔注射致敏，2周后第二次致敏，10天后以1％OVA霧化吸入激發(fā)，每次40min，每周連續(xù)霧化吸入3天，連續(xù)8周。最后一次激發(fā)后24小時(shí)行氣道反應(yīng)性測定。48小時(shí)收集標(biāo)本，行支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，肺組織病理切片觀察氣道炎癥、氣道周圍平滑肌增生、膠原沉積

10、和黏液分泌情況。
　　 結(jié)果：OVA組小鼠經(jīng)抗原致敏和反復(fù)激發(fā)后出現(xiàn)了典型的氣道重塑特征，包括氣道周圍平滑肌明顯增生、膠原沉積增加、氣道黏液高分泌以及氣道和血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤，同時(shí)氣道反應(yīng)性明顯增高。而早期多次BCG接種后的小鼠（BCG+OVA組）BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)減少，尤其Eos減少更明顯（P﹤0.01）。氣道周圍平滑肌增生和膠原沉積較OVA組減少，尤其以直徑150-250μm的小氣道周圍減少明顯（P﹤0.05）。氣

11、道反應(yīng)性也較OVA組降低（P﹤0.05）。
　　 結(jié)論：我們通過OVA抗原致敏和反復(fù)霧化吸入激發(fā)的方法構(gòu)建了穩(wěn)定的具有典型氣道重塑特征和氣道高反應(yīng)性的小鼠慢性哮喘模型。新生鼠早期多次BCG接種可降低慢性哮喘模型氣道周圍炎癥細(xì)胞尤其是Eos的浸潤，減輕氣道周圍平滑肌增生和膠原沉積，降低氣道高反應(yīng)性，其中對小氣道周圍氣道重塑的抑制較中大氣道更為明顯。
　　 第二部分：早期多次卡介苗接種減輕哮喘氣道重塑的相關(guān)免疫機(jī)制
　

12、　 目的：觀察早期多次BCG接種后肺組織T細(xì)胞免疫應(yīng)答的變化。觀察BCG接種對肺組織中Eos活化因子和趨化因子表達(dá)的影響，以及對影響氣道重建的重要因子TGF-β1表達(dá)的影響。
　　 方法：最后一次抗原激發(fā)后48小時(shí)行肺泡灌洗，ELISA法檢測灌洗液上清中IFN-γ、IL-5、IL-17、IL-13、eotaxin-1、TGF-βl的水平。分離肺組織淋巴細(xì)胞，經(jīng)PMA刺激后行表面抗體標(biāo)記（CD3，CD4，CD8，CD25），細(xì)胞

13、破膜處理后標(biāo)記胞內(nèi)抗體（IFN-γ，IL-4，IL-17A，IL-10，F(xiàn)oxp3），流式細(xì)胞術(shù)檢測和分析各T細(xì)胞亞群的比例。另取肺組織提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后用real-time PCR法檢測IFN-γ，IL-17A和Fopx3mRNA的表達(dá)。肺組織石蠟切片行TGF-β1免疫組化染色，圖像分析計(jì)數(shù)氣道基底膜外圍30μmm范圍內(nèi)TGF-β1+細(xì)胞數(shù)。
　　 結(jié)果：與SHAM組相比，OVA組表達(dá)IL-4和表達(dá)IL-17的T細(xì)胞比例增

14、高，而表達(dá)IFN-γ的T細(xì)胞比例無明顯變化。BCG多次接種后肺組織中表達(dá)IFN-γ的T細(xì)胞明顯增高達(dá)4倍，尤其表現(xiàn)為Thl細(xì)胞的增加（5.01±0.66％ vs0.83±0.18％ ofCD3+T cells，BCG+OVA vs OVA，P﹤0.01）。Thl7細(xì)胞、Th2細(xì)胞和Treg在OVA組和BCG+OVA組之間無明顯差別。real-time PCR檢測結(jié)果與流式分析的結(jié)果一致，BCG接種后僅發(fā)現(xiàn)促進(jìn)FN-γmRNA明顯增高，而

15、IL-17A和Fopx3mRNA水平在BCG+OVA組與OVA組之間無明顯差異，但這兩組的IL-17AmRNA水平均較SHAM組明顯增高。用ELISA方法檢測BALF中細(xì)胞因子表達(dá)水平，結(jié)果顯示：OVA組和SHAM組IFN-γ水平無明顯差異，BCG接種組IFN-γ較未接種組明顯增高（P﹤0.05）。OVA組BALF中IL-5和Eotaxin-1水平較SHAM組顯著增加，BCG+OVA組IL-5和Eotaxin-1水平均下降，兩組間相比差

16、異有顯著性。IL-13水平OVA組較SHAM組高，BCG+OVA組較OVA組有下降，但統(tǒng)計(jì)無顯著差異。IL-17水平各組中均很低，在檢測的敏感性之外。BALF中TGF-β1水平用ELISA方法檢測結(jié)果顯示：OVA組BALF中TGF-β1水平較SHAM組顯著增加，BCG+OVA組TGF-β1水平較OVA組下降，兩組間相比差異有顯著性。肺組織切片TGF-β1免疫組化染色發(fā)現(xiàn)：OVA組氣道周圍TGF-β1染色陽性的細(xì)胞數(shù)較SHAM組明顯增高，