新生兒持續(xù)肺動脈高壓遺傳病因及血清標(biāo)志物初步研究.pdf

1、新生兒持續(xù)肺動脈高壓(PPHN)是指出生后胎兒型循環(huán)向成人型循環(huán)過渡時發(fā)生障礙，肺血管壓力持續(xù)增高并超過體循環(huán)動脈壓，引起心房和（或）動脈導(dǎo)管水平血液右向左分流，臨床出現(xiàn)嚴(yán)重低氧血癥甚至死亡的一種疾病。
　　國內(nèi)外成人及兒童研究顯示:家族性、特發(fā)性和先天性心臟病相關(guān)性肺動脈高壓(PAH)與BMPR2、ALK1等基因突變有關(guān)。另有報道指出CPS1、ABCA3、CRHR1基因變異以及表觀遺傳可能參與PPHN的發(fā)生。
　　PAH的

2、臨床研究認(rèn)為，肺血管的收縮和舒張受血管活性因子調(diào)節(jié)，其中比較重要的有一氧化氮(NO)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、內(nèi)皮素（ET-1）。有研究提示，上述因子合成相關(guān)基因NOS3、VEGFA、ACE、EDN1、突變或多態(tài)性和相應(yīng)血清因子濃度存在一定的關(guān)聯(lián)性。
　　既往認(rèn)為PPHN病因主要包括:宮內(nèi)慢性缺氧或圍生期窒息，宮內(nèi)或生后感染，呼吸窘迫綜合征和胎糞吸入綜合征等肺實(shí)質(zhì)性疾病，肺發(fā)育不良和先天性膈疝等。近

3、年來遺傳因素在PPHN中所起的作用日益受到關(guān)注，NOS3、EDN1、ACE、VEGFA基因突變或多態(tài)性是否與PPHN易感性有關(guān)？而上述基因變異是否導(dǎo)致了血管活性因子濃度的改變？
　　本研究旨在探索NOS3、EDN1、ACE、VEGFA基因變異和PPHN易感性的關(guān)系并試圖尋找基因變異對相應(yīng)血清因子濃度的影響。
　　第一部分 ACE、EDN1、VEGFA、NOS3基因多態(tài)性和新生兒持續(xù)肺動脈高壓易感性研究
　　目的:探索P

4、PHN患兒是否存在ACE、EDN1、VEGFA、NOS3基因突變，或者是否存在相關(guān)SNP和PPHN易感性有關(guān)。
　　方法:在2013年1月至2014年1月期間，收集復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院NICU中因為呼吸窘迫需輔助通氣患兒血標(biāo)本，納入對象符合PPHN診斷條件為PPHN組，余為非PPHN組，提取DNA，預(yù)實(shí)驗利用Ion Torrent Ampliseq panel技術(shù)檢測兩組新生兒ACE、EDN1、VEGFA、NOS3基因編碼區(qū)有無突

5、變，比較PPHN組和非PPHN組相關(guān)基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率有無差異。發(fā)現(xiàn)陽性位點(diǎn)后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量Sanger測序法驗證。
　　結(jié)果:共收集PPHN組55例，非PPHN組27例，兩組患兒在性別構(gòu)成、出生體重、納入時間上差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而在胎齡上，非PPHN組略小。預(yù)實(shí)驗完成Ion Torrent測序30例，包括PPHN組20例，非PPHN組10例。Ion Torrent檢測未發(fā)現(xiàn)上述基因突變，共發(fā)現(xiàn)SNP49個。其中

6、EDN1基因多態(tài)性位點(diǎn)rs5370、rs2070699、rs1800543基因型及等位基因頻率在兩組中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。就上述3個SNP位點(diǎn)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗證后發(fā)現(xiàn)，EDN1 rs2070699基因型頻率和等位基因頻率在PPHN和非PPHN組間差異仍然有統(tǒng)計學(xué)意義，PPHN組TT基因型頻率(30.9％)顯著高于非PPHN組(11.1％)，x2=7.2，P=0.003，OR值:3.58，95％CI:0.882-20.783。PPHN組

7、T等位基因頻率(54.5％)顯著高于非PPHN組(31.5％), x2=7.75,P=0.005, OR值:7.00,95％CI:1.820-29.493。
　　結(jié)論:EDN1 rs2070699可能和PPHN易感性有關(guān)，T等位基因在缺氧時能增加PPHN的發(fā)病風(fēng)險。
　　第二部分 新生兒持續(xù)肺動脈高壓患兒血清ET-1、VEGF、NO和ACE濃度變化
　　目的:探討PPHN血管活性因子濃度變化，并尋找ET-1濃度改變和E

8、DN1基因變異之間可能的關(guān)聯(lián)。
　　方法:在2013年7月至2014年1月期間，收集復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院NICU中因為呼吸窘迫需輔助通氣患兒血標(biāo)本，納入對象符合PPHN診斷條件為PPHN組，余為非PPHN組，選擇同時期入住普通新生兒病房的無心肺疾病的黃疸或咽下綜合征新生兒作為正常對照組。應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測血清ET-1、ACE、VEGF濃度，比色法間接測定NO濃度。
　　結(jié)果:共檢測PPHN組25例，非PPHN組13例，正常對

9、照組20例。三組胎齡、體重和日齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。VEGF[(472.3±360.9)、(783.1±312.9)、(826.2±528.3) pg/mL]和ET-1[(2.8±2.5)、(1.9±1.3)、(0.7±0.9) pg/mL]在三組中的濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=8.12，P=0.02;x2=21.72，P=0.00）ACE和NO在三組間的濃度差異無統(tǒng)計學(xué)章義（x2=1.09，P=0.58; x2=3.82，P=0.15）

10、。EDN1 rs2070699位點(diǎn)T等位基因可能為PPHN的危險因素，故將GT型和TT型合并為一大類，與GG型患兒ET-1濃度作比較，共32例患兒同時完成EDN1和ET-1檢測，其中基因型為GG型11例，ET-1濃度1.36±0.93 pg/mL，GT+TT型患兒21例，ET-1濃度3.12±2.64 pg/mL。T等位基因攜帶者血清ET-1濃度更高，Mann-Whitney檢驗，U=63.5,P=0.039。
　　結(jié)論:PPHN