紋狀體老化與病變的羰基應(yīng)激機(jī)制及運(yùn)動(dòng)抗逆作用研究.pdf

1、增齡性老化是帕金森病(Parkinson's disease，PD)等神經(jīng)退行性疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，神經(jīng)退行或病變成為影響人口健康和生活質(zhì)量的公共健康問題，更是一個(gè)值得科學(xué)研究的重大問題。推動(dòng)PD等疾病相關(guān)基礎(chǔ)與臨床研究窗口前移勢(shì)在必行，本文從羰基應(yīng)激等衰老共性生化過程出發(fā)，構(gòu)建增齡性紋狀體老化模型和6-OHDA致帕金森疾病模型，進(jìn)而通過規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)，探討紋狀體增齡性老化和PD發(fā)生過程中的羰基應(yīng)激及相關(guān)調(diào)控機(jī)制、以及規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)紋

2、狀體增齡性老化和PD的作用，致力于篩選神經(jīng)退行性變?cè)缙诘男碌陌袠?biāo)，為PD的發(fā)生發(fā)展和運(yùn)動(dòng)延緩神經(jīng)退行或PD病變的機(jī)制提供重要的理論意義與臨床指導(dǎo)意義。
　　方法:以SPF級(jí)雄性SD大鼠為研究對(duì)象。(1)將6月齡（青年）、16月齡（中年）和25月齡（老年）大鼠各分為兩組，對(duì)照組Y-SED、M-SED和O-SED靜息、運(yùn)動(dòng)組Y-EX、M-EX和O-EX實(shí)施10周遞增負(fù)荷規(guī)律的中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)。通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行行為學(xué)監(jiān)測(cè)，檢測(cè)血液

3、生化指標(biāo)，以及紋狀體電鏡檢測(cè)和凋亡檢測(cè)等獲得相關(guān)體視學(xué)指標(biāo)。采用改良親和素-生物素珠富集羰基蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析蛋白質(zhì)的羰基化修飾機(jī)制，并用丹麥 Exiqon公司研發(fā)的miRNA微陣列芯片miRCURYTM LNA Array(v.18.0)等方法分析羰基化蛋白質(zhì)的調(diào)控機(jī)制，用qRT-PCR、免疫組化(IHC)和免疫印跡(WB)等對(duì)篩選的相關(guān)通路的蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。(2)將16月齡大鼠分為PD安靜組(SED-PD)和運(yùn)動(dòng)組(EX-PD)，同

4、時(shí)組內(nèi)以相應(yīng)的正常側(cè)SED-NOR和EX-NOR作為對(duì)照，運(yùn)動(dòng)組經(jīng)預(yù)先8周遞增負(fù)荷中等強(qiáng)度規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)后，兩組大鼠同時(shí)構(gòu)建6-OHDA致使的PD病變模型。在確定PD大鼠模型造模成功后，采用(1)的方法分析PD過程中的羰基應(yīng)激機(jī)制及運(yùn)動(dòng)干預(yù)的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:(1)大鼠增齡過程中運(yùn)動(dòng)行為學(xué)、組織形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)等相關(guān)指標(biāo)發(fā)生老化退行性改變。水平繩實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各年齡安靜組大鼠出現(xiàn)增齡性下降趨勢(shì)顯著(P＜0.05)。電鏡觀察老年大鼠

5、紋狀體的絨毛排列明顯混亂，絨毛疏松，絨毛上面或者之間結(jié)節(jié)狀突觸較少，絨毛的光滑程度下降。增齡大鼠紋狀體均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡核，凋亡發(fā)生率為100％,呈現(xiàn)增齡性趨勢(shì)。與Y-SED相比較，M-SED細(xì)胞凋亡指數(shù)增加了288.88％(P＜0.05)，而O-SED細(xì)胞凋亡指數(shù)增加了392.22％(P＜0.05)。與Y-SED組相比較，M-SED和O-SED組的細(xì)胞自噬因子(Beclin1)/β-actin比值上升趨勢(shì)(P＜0.05)，與凋亡呈高度相關(guān)

6、。
　　改良親和素-生物素珠富集羰基化蛋白質(zhì)經(jīng)ESI-Q-TOF-MS/MS鑒定，發(fā)現(xiàn)羰基化蛋白質(zhì)沒有呈現(xiàn)增齡性遞增變化，羰基化修飾對(duì)蛋白質(zhì)具有選擇性，蛋白質(zhì)的相對(duì)數(shù)量并不是蛋白質(zhì)羰基化程度的決定因素;得出青年大鼠羰基化蛋白質(zhì)數(shù)量78個(gè)、老年次之69個(gè)和中年52個(gè)，而氧化修飾位點(diǎn)的羰基化蛋白質(zhì)鑒定率中年最高76.47％、老年次之72.63％和青年最低69.65％。主要涉及能量代謝、線粒體內(nèi)膜、ATP酶活性、黑質(zhì)發(fā)育、突觸傳導(dǎo)調(diào)節(jié)、

7、軸突部位和老化等。增齡性老化過程中具有重要作用的羰基化蛋白質(zhì)與AMPK、CaMK和PI3R/Akt/mTOR信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)。與Y-SED和M-SED組相比較，O-SED組的AMPKα1/β-actin比值上升趨勢(shì)(P＜0.05);CaMKⅡα和Vdac1的表達(dá)呈現(xiàn)年齡增齡性趨勢(shì)，與Y-SED相比較，M-SED和O-SED的CaMKⅡα和Vdac1表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05);PI3K、Akt和mTOR表達(dá)呈現(xiàn)隨著年齡增齡性下調(diào)，與

8、Y-SED相比較，O-SED的PI3K、Akt和mTOR表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)。表明這三條信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)增齡過程中紋狀體細(xì)胞凋亡與自噬的平衡穩(wěn)定，從而影響增齡性老化的發(fā)生發(fā)展。
　　(2)從掃描電子顯微鏡觀察得出，與Y-SED組相比，Y-EX組大鼠紋狀體的絨毛列規(guī)則并緊密，結(jié)節(jié)狀的數(shù)量更多，而且體積更大;M-EX和O-EX組與相應(yīng)的M-SED和O-SED組相比較，絨毛列緊密，結(jié)節(jié)狀的數(shù)量更多。規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)提高了各年齡大鼠紋

9、狀體BDNF的表達(dá)水平(P＜0.05)，呈現(xiàn)年齡增齡性趨勢(shì)。規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)本身對(duì)大鼠血液內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化與組織中的相應(yīng)指標(biāo)的變化趨勢(shì)不同，呈現(xiàn)了其本身是一種應(yīng)激刺激。實(shí)施規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)的各年齡組大鼠紋狀體細(xì)胞凋亡指數(shù)分別增加了205.56％、57％和68.24％(P＜0.01)。而Beclin1/β-actin比值均顯著上升(P＜0.05)，其中M-EX和O-EX組顯著增加(P＜0.01)。
　　質(zhì)譜鑒定出規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)線粒體

10、和黑質(zhì)發(fā)育相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基化產(chǎn)生了一定的影響，改善了與老化過程有關(guān)的鈣網(wǎng)蛋白、與DNA有重要關(guān)系的核內(nèi)不均一核糖核蛋白A2/B1等、與黑質(zhì)發(fā)育及突觸密切相關(guān)的14-3-3蛋白等的羰基化。芯片結(jié)果顯示規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)上調(diào)miRNA207和下調(diào)miRNA542的表達(dá)，涉及與神經(jīng)老化或者神經(jīng)退行有著密切關(guān)系的刺激神經(jīng)系統(tǒng)配合受體相互作用通路、鈣調(diào)信號(hào)通路、γ-氨基丁酸突觸信號(hào)通路和糖酵解信號(hào)通路等。結(jié)果顯示規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)使大鼠紋狀體AMPK

11、α1/β-actin比值均顯著上升(P＜0.05)，呈現(xiàn)了增齡性趨勢(shì)，與相應(yīng)的安靜組相比較，Y-EX、M-EX和O-EX組的AMPKα1/β-actin分別上升46.18％、62.85％和22.84％(P＜0.05);各年齡安靜組與運(yùn)動(dòng)組相比較，CaMKⅡα和Vdac1的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，其中M-EX比 M-SED的上調(diào)具有非常顯著性(P＜0.01); M-EX和O-EX與相應(yīng)的M-SED和O-SED相比較，PI3K、Akt

12、和mTOR表達(dá)上調(diào)，其中與O-SED相比較，O-EX的PDK、Akt和mTOR表達(dá)上調(diào)顯著(P＜0.01)。得出規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)有利于紋狀體的生物學(xué)功能和改善神經(jīng)老化的機(jī)制，是通過激發(fā)大鼠紋狀體的AMPK、CaMK和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路共同參與了運(yùn)動(dòng)可以調(diào)控細(xì)胞自噬與凋亡發(fā)生的平衡穩(wěn)態(tài)。
　　(3)6-OHDA致PD大鼠的模型構(gòu)建成功，造模過程中沒有引起醫(yī)源性的炎癥反應(yīng)和大面積細(xì)胞凋亡或壞死;掃描電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)紋狀體軸突與

13、神經(jīng)絨毛的萎縮等形態(tài)學(xué)改變與帕金森病的發(fā)生有著密切關(guān)系。采用透射電子顯微鏡和TUNEL均可觀察到凋亡細(xì)胞核，PD模型大鼠紋狀體的細(xì)胞凋亡發(fā)生率為100％。SED-NOR組比正常安靜組M-SED組的凋亡指數(shù)上升顯著(P＜0.01)。與SED-NOR組相比，SED-PD組的凋亡指數(shù)上升40.72％(P＜0.01)。免疫印跡結(jié)果顯示，與SED-NOR組相比較，SED-PD組的Beclin1/β-actin比值下降(P＜0.05)。
　　

14、質(zhì)譜鑒定出PD病交過程中具有重要作用的羰基化蛋白質(zhì)涉及線粒體內(nèi)膜、能量代謝、黑質(zhì)發(fā)育、突觸傳導(dǎo)調(diào)節(jié)、微管、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白。與SED-NOR相比較，SED-PD的AMPK表達(dá)明顯上升(P＜0.01);與SED-NOR相比較，SED-PD的CaMKⅡα、CaMKV和Vdac1表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01);與SED-NOR相比較，SED-PD的PI3R、Akt和mTOR表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)。得出紋狀體神經(jīng)細(xì)胞自噬的障礙

15、與PD的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而AMPK通路與CaMK信號(hào)通路的下調(diào)一定程度促進(jìn)了凋亡的發(fā)生率，對(duì)于PD病變的調(diào)控起著重要的作用。
　　(4)預(yù)先規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)提高了6-OHDA致帕金森大鼠的損傷抗逆能力;對(duì)ATP酶活性和酰胺結(jié)合相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基化有一定的影響，改善了與老化及退行性疾病有關(guān)的CamⅡα、 HSP60、Syn1、Map1和Map2蛋白被羰基化;通過上調(diào)miRNA3557和下調(diào)miRNA324

16、，調(diào)節(jié)與帕金森有著密切關(guān)系的刺激神經(jīng)系統(tǒng)配合受體相互作用通路、鈣調(diào)信號(hào)通路、糖基磷脂酰肌醇生物合成、細(xì)胞內(nèi)吞作用和核苷酸切除修復(fù)等。與EX-NOR組相比較，EX-PD組的AMPKα1/β-actin比值上升(P＜0.05);與SED-PD組相比較，EX-PD組的AMPKα1/β-actin比值卻出現(xiàn)下降(P＜0.05)。與SED-NOR相比較，EX-NOR的CaMKⅡα、CaMKV和Vdac1的表達(dá)都明顯下調(diào)(P＜0.01);與SED-

17、PD相比較，EX-PD的CaMKV和Vdac1表達(dá)稍微下調(diào)(P＞0.05)，只有EX-PD的CaMKⅡα表達(dá)稍微上升(P＞0.05)。與EX-NOR相比，EX-PD的PI3R、Akt和mTOR表達(dá)也明顯上調(diào)(P＜0.01)。但是與SED-PD相比較，EX-PD的PI3R和mTOR表達(dá)稍微上調(diào)(P＞0.05)，而Akt卻明顯下調(diào)(P＜0.01)。與SED-PD相比較，EX-PD的Syp和Ywhah表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05，P＜0.01)

18、，其中UCH-L1表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。得出預(yù)先規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)了PD大鼠紋狀體的自噬與凋亡適當(dāng)增加，下調(diào)了AMPK通路與CaMK信號(hào)通路，而激活了PI3R/Akt/mTOR信號(hào)通路，PI3R/Akt/mTOR協(xié)調(diào)AMPK通路與CaMK信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，從而提高了UCH-L1表達(dá)水平與細(xì)胞自噬一起聯(lián)合抑制PD病變的發(fā)生或發(fā)展。
　　結(jié)論:增齡性老化與帕金森病變的發(fā)生發(fā)展過程中，羰基化修飾對(duì)蛋白質(zhì)具有選擇性，蛋白質(zhì)的相對(duì)數(shù)量并

19、不是蛋白質(zhì)羰基化程度的決定因素，而與AMPK、CaMK和PI3R/Akt/mTOR信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)蛋白質(zhì)羰基化有著密切關(guān)系。規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)延緩神經(jīng)退行及病變的適應(yīng)性機(jī)制是一種抗逆鍛煉作用機(jī)理:運(yùn)動(dòng)使能量-氧應(yīng)激穩(wěn)態(tài)的適應(yīng)性變化，而AMPK、CaMK和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的相關(guān)蛋白質(zhì)羰基化修飾，啟動(dòng)miRNA調(diào)控其靶通路之一CaMK信號(hào)通路，協(xié)調(diào)該通路有密切相關(guān)的AMPK通路與PI3K/Akt/mTOR通路的相關(guān)蛋白表達(dá)，從