拉莫三嗪、?；撬岷挺?氨基丁酸對癲癇模型的神經(jīng)保護(hù)作用及抗羰基應(yīng)激機(jī)制的研究.pdf

1、癲癇發(fā)病機(jī)制一直還未完全闡明,但癲癇的發(fā)生、發(fā)展與神經(jīng)遞質(zhì)特別是興奮性氨基酸(EAAs)神經(jīng)遞質(zhì)及氧化、羰基緊張密切相關(guān)。本研究從癲癇發(fā)生、發(fā)展的促發(fā)因素入手,研究癲癇的預(yù)防和治療,既研究抑制興奮性毒性又考慮清除毒性羰基。拉莫三嗪(LTG)是一種新型的抗癲癇藥物,它的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用方式都代表了癲癇治療的新途徑。該藥主要通過阻斷興奮性電壓依賴性鈉通道發(fā)揮抗癲癇作用,同時(shí)也可降低鈣內(nèi)流或通過某些尚未明確的作用機(jī)制發(fā)揮廣譜抗癲癇作用。有研究表

2、明,LTG能調(diào)節(jié)谷氨酸在突觸前膜的釋放,多年來倍受關(guān)注。而?；撬?、γ-氨基丁酸(GABA)本身是兩個(gè)抑制性氨基酸(IAAs)神經(jīng)遞質(zhì)。具有很重要的抑制興奮的生理功能。本論文采用活體微透析技術(shù),配合高靈敏的檢測手段,研究不同自由活動(dòng)清醒致癇模型鼠的海馬神經(jīng)元間隙主要興奮性氨基酸類(EAAs)活性遞質(zhì)動(dòng)態(tài)釋放和LTG干預(yù)治療的影響,考察LTG對不同致癇模型的神經(jīng)保護(hù)作用,并特別考察了所建立的新生鼠驚厥模型的神經(jīng)保護(hù)作用,擴(kuò)展了新生兒用藥的藥

3、理作用及安全性;探討了LTG、牛磺酸和GABA抗羰基的作用及機(jī)制。進(jìn)一步闡述了LTG、?；撬岷虶ABA抗癲癇的作用機(jī)制。本研究為LTG臨床上更有效更廣泛地運(yùn)用新型抗癲癇藥進(jìn)行抗癲癇的藥物治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為癲癇的治療提供了新的治療策略,為新藥開發(fā)的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提供了新的思路。主要研究的內(nèi)容如下:
　　 1、考察了拉莫三嗪對持續(xù)性癲癇、慢性點(diǎn)燃癲癇模型干預(yù)治療后,EAAs活性神經(jīng)遞質(zhì)在自由活動(dòng)的清醒大鼠生理及病理狀態(tài)下腦組織癲癇

4、病灶的釋放的影響。本研究以戊四氮(PTZ)為致癇劑,建立持續(xù)性癲癇、慢性點(diǎn)燃癲癇模型,運(yùn)用腦內(nèi)在體微透析技術(shù)結(jié)合高效液相(HPLC)檢測獲得了較為滿意的結(jié)果;在持續(xù)性癲癇、慢性點(diǎn)燃癲癇大鼠模型里,主要的EAA神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)水平在癲癇大鼠海馬神經(jīng)元間隙液明顯升高,相對正常組都有顯著差異,且慢性點(diǎn)燃癲癇模型的EAA高于持續(xù)性癲癇模型;兩種模型組給予20mg/kg LTG預(yù)防或治療后,其組織間隙細(xì)胞外EAA濃度顯著下降,由此說明急性應(yīng)用LTG對

5、中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的EAA的釋放有抑制和預(yù)防保護(hù)作用。托吡酯(TPM)是新型EAA受體拮抗劑,而LTG是EAA調(diào)節(jié)劑。急性應(yīng)用LTG和TPM干預(yù)慢性點(diǎn)燃癲癇模型后,發(fā)現(xiàn)兩種抗癲癇藥都對慢性點(diǎn)燃癲癇模犁抑制EAA神經(jīng)遞質(zhì)具有顯著治療效果,然而控制效果LTG優(yōu)于TPM,說明LTG與谷氨酸受體拮抗劑托吡酯都具有很強(qiáng)的抑制EAA釋放的治療效果,但EAAs的調(diào)節(jié)釋放優(yōu)于受體拮抗。
　　 2、考察了不同劑量(分別為5、10、20和40 mg/

6、kg)拉莫三嗪對圍產(chǎn)期新生鼠藥物誘導(dǎo)驚厥模型EAAs活性神經(jīng)遞質(zhì)在自由活動(dòng)的清醒新生鼠生理及病理狀態(tài)下腦組織病灶中釋放的影響,跟蹤觀察了其遠(yuǎn)期腦組織苔蘚纖維發(fā)芽,并與反復(fù)驚厥模型EAA的釋放變化進(jìn)行了比較。本研究以戊四氮為致癇劑,建立急性驚厥模型,運(yùn)用腦內(nèi)在體微透析技術(shù)結(jié)合HPLC法分析,得到的結(jié)果表明,通過新生鼠單次驚厥模型與反復(fù)驚厥模型EAA濃度變化的比較,發(fā)現(xiàn)PTZ單次大劑量誘導(dǎo)對敏感期新生鼠的興奮性影響非常大,但這兩種驚厥模型中

7、哪一種對神經(jīng)元的損傷程度大還需進(jìn)一步的闡述。用不同劑量干預(yù)單次驚厥模型,通過比較主要EAA的釋放,發(fā)現(xiàn)10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg三種劑量部分或全部監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)都有顯著的治療效果,但相互之問沒有顯著性差異,而40 mg/kg LTG劑量相對于5 mg/kg的劑量部分時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異,說明作用療效與劑量有關(guān),且20 mg/kg劑量為最佳治療量。通過急性應(yīng)用20 mg/kg拉莫三嗪對單次驚厥模型干預(yù)后的遠(yuǎn)期腦組織苔蘚

8、纖維發(fā)芽進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)單次驚厥在齒狀同顆粒上層的苔蘚纖維發(fā)芽分?jǐn)?shù)顯著高于正常鼠和20 mg/kg拉莫三嗪干預(yù)組,說明20 mg/kg拉莫三嗪具有遠(yuǎn)期神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 3、考察缺氧驚厥模型圍產(chǎn)期缺氧后及LTG干預(yù)后未成熟鼠腦內(nèi)的EAA濃度的動(dòng)態(tài)變化,跟蹤觀察其遠(yuǎn)期腦組織苔蘚纖維發(fā)芽和測定學(xué)習(xí)記憶能力,探究單純急性缺氧對未成熟鼠的近、遠(yuǎn)期影響;并進(jìn)一步與促紅細(xì)胞生成素(EPO)干預(yù)后的相應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比較,從而評價(jià)LTG干預(yù)新生鼠的

9、近、遠(yuǎn)期療效并探討其作用機(jī)制。利用上述圍產(chǎn)期新生鼠PTZ致癇模型中主要興奮性氨基酸的濃度變化的數(shù)據(jù),考察了缺氧引起驚厥模型與PTZ致驚厥EAA的差異。研究結(jié)果表明,從興奮毒性考慮,缺氧EAA的濃度很高,顯著高于PTZ致癇的EAA濃度,并有延長效應(yīng)。LTG作為EAA調(diào)節(jié)劑用于缺氧驚厥的治療,從機(jī)制上看,是潛在的良好的神經(jīng)保護(hù)作用的藥物而可用于治療圍產(chǎn)期缺氧驚厥導(dǎo)致的腦損傷。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,單次常氧注射20 mg/kg LTG具有一定的安全

10、性,在近期及遠(yuǎn)期均未顯示明顯的神經(jīng)元丟失,未見苔蘚纖維發(fā)芽,在學(xué)習(xí)記憶能力方面未見下降,且癲癇發(fā)作敏感性升高。20 mg/kg LTG能迅速顯著地減少圍產(chǎn)期缺氧后的EAA濃度的釋放;在P30,Y-型電迷宮測試中LTG干預(yù)組達(dá)到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)所需次數(shù)明顯少于缺氧-NS組;24小時(shí)記憶保持率均高于缺氧-NS組;尼氏染色顯示各組在P10、P30兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未見明顯腦神經(jīng)元丟失現(xiàn)象;在P30，Timm染色結(jié)果顯示,缺氧-LTG組在齒狀回顆粒上層的苔蘚

11、纖維發(fā)芽分?jǐn)?shù)較缺氧-NS組明顯降低,說明單次應(yīng)用20 mg/kg LTG后,對缺氧驚厥導(dǎo)致的遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)和記憶能力的下降及對致癇藥物的耐受性的降低等不良后果有所改善,降低了驚厥易感性;LTG可能主要通過持續(xù)顯著地降低圍產(chǎn)期缺氧后EAA濃度的釋放,從而減少EAAs的興奮性毒性作用,最終起到遠(yuǎn)期神經(jīng)保護(hù)作用,但不是唯一的因素;本研究還選用安全性良好的生物制品EPO與LTG的干預(yù)治療進(jìn)行比較,EPO也能顯著地減少EAA的釋放,但不能完全抑制苔蘚纖

12、維發(fā)芽,也就是說不能完全阻止癲癇的遠(yuǎn)期發(fā)展趨勢。相對來說,單次20 mg/kg LTG阻止了圍產(chǎn)期缺氧驚厥遠(yuǎn)期發(fā)展為慢性癲癇的發(fā)展趨勢,在這一點(diǎn)上,更優(yōu)于EPO?？傊?LTG對圍產(chǎn)期缺氧驚厥具有近期和遠(yuǎn)期的神經(jīng)保護(hù)作用,且具有一定安全性。
　　 4、考察了LTG、牛磺酸和GABA分別對癲癇模型過氧化的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究擬以PTZ為致癇劑,建立急性癲癇模型,通過研究MDA、SOD等來考察LTG、牛磺酸和GABA對癲癇模型抗氧化、

13、羰基應(yīng)激的作用效果。研究結(jié)果可知,在大腦海馬及皮質(zhì)和血清里,模型組MDA的含量升高,SOD酶的活性降低,在大腦海馬及皮質(zhì),GSH-Px和Na+K+-ATP酶的活性降低。LTG、GABA和牛磺酸都能顯著降低大腦皮質(zhì)和降低海馬和血清MDA的含量,顯著提高大腦皮質(zhì)和海馬的SOD、GSH-Px的活性,且三組干預(yù)組之間沒有顯著性差異,與正常組也沒有顯著性差異;LTG、GABA能提高Na+K+-ATP酶的活性,有效控制癲癇的發(fā)作,但?；撬釋a+K

14、+-ATP酶的效果較弱,且與LTG、GABA干預(yù)組有顯著性差異。以上結(jié)果表明:LTG、?；撬岷虶ABA都對癲癇模型具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、保護(hù)神經(jīng)組織的作用,但控制癲癇的發(fā)作LTG、GABA比?；撬釓?qiáng)。
　　 5、考察了牛磺酸和GABA抗羰基應(yīng)激的機(jī)制。研究它們在生理?xiàng)l件下能否與丙二醛(MDA)反應(yīng),從而保護(hù)組織蛋白免于活性如MDA的氧化修飾。?；撬岷虶ABA是神經(jīng)系統(tǒng)的重要抑制性神經(jīng)遞質(zhì),谷氨酸和天冬氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)的主

15、要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),考慮癲癇病灶內(nèi)源性的氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)是否具有清除毒性羰基化合物的作用,故同時(shí)假設(shè)Glu、Asp也具有清除如MDA的活性羰基化合物的功能,并與?；撬岷虶ABA的清除能力進(jìn)行比較。MDA是氧化緊張、脂質(zhì)過氧化的典型羰基中間體。研究結(jié)果表明:在生理?xiàng)l件下?；撬帷ABA、谷氨酸和天冬氨脧與MDA溫浴24h直接誘捕MDA,經(jīng)HPLC、質(zhì)譜(LC/MS)等分析手段分析,發(fā)現(xiàn)?；撬岷虶ABA與MDA直接反應(yīng)比較快,而Glu和Asp

16、較慢,通過HFLC分離,主要生成兩種產(chǎn)物,一種是沒有熒光的紫外吸收峰為274～278 nm的產(chǎn)物,一種是有熒光的產(chǎn)物,這種類似脂褐素(Ex392-395 nm/Em456-364 nm)的熒光產(chǎn)物是1,4-二氫吡啶衍生物;而谷氨酸和天冬氨酸與MDA在生理?xiàng)l件下反應(yīng),通過分析,谷氨酸和天冬氨酸都只生成一種非熒光產(chǎn)物。?；撬岷虶ABA與不飽和脂肪酸一起培育后含量的下降及MDA含量的減少,說明?；撬岷虶ABA在生理?xiàng)l件下具有強(qiáng)抗羰基毒性的功能

17、。牛磺酸和GABA,這兩種IAAs神經(jīng)遞質(zhì),又可作為抗氧化劑,抑制氧化緊張時(shí)活性羰基中間體的形成。研究數(shù)據(jù)表明,?；撬岷虶ABA具有很強(qiáng)的清除內(nèi)源性和/或外源性不飽和活性羰基的能力。相對而言,EAAs神經(jīng)遞質(zhì)Glu和Asp清除功能較弱,這與氨基酸本身的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。此外,通過?；撬崤cMDA、BSA反應(yīng),可知?；撬崮芤种频鞍佐驶男纬?。由上述結(jié)果可知,?；撬峥蛇M(jìn)一步抑制AGEs/ALEs的形成。?；撬岷虶ABA抑制羰基/氧化緊張的機(jī)制也