NDRG2在熱應(yīng)激抗肝癌細(xì)胞侵襲中的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌主要以肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生為主,為常見的惡性腫瘤之一,并且在世界各地發(fā)病率每年呈明顯上升趨勢,在我國其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中排第二位。由于肝癌常缺乏典型的臨床表現(xiàn),早期無明顯癥狀,多數(shù)患者確診時(shí)往往已處于晚期,出現(xiàn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前針對肝癌的主要治療手段是對原發(fā)腫瘤的外科手術(shù)切除。肝癌一旦發(fā)生其他臟器的轉(zhuǎn)移則明顯影響預(yù)后,術(shù)后的生存率也隨之降低。在肝癌導(dǎo)致死亡的病例中,

2、腫瘤引發(fā)的侵襲、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)是致死的主要原因。因此,尋找一種有效,安全的控制肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的治療方法,對于降低肝癌的死亡率具有重要的意義。
　　腫瘤熱療是一種依靠物理能量使人體全身或局部加熱,利用正常組織和腫瘤組織對溫度耐受能力的差異,達(dá)到既能殺傷腫瘤細(xì)胞又不損傷正常細(xì)胞的治療方法。研究發(fā)現(xiàn),它不僅可以對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接或間接的殺傷致死效應(yīng),它還可干涉腫瘤轉(zhuǎn)移的多個(gè)環(huán)節(jié)從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。盡管目前在熱療抗腫瘤方面的研究

3、方面已取得了重大進(jìn)展,但由于欠缺充分、具體的作用機(jī)制,所以影響了它在臨床實(shí)踐中的深入應(yīng)用。
　　人N-Myc下游調(diào)節(jié)基因-2(N-Myc downstream regulated gene2,NDRG2)屬于NDRG家族,是1999年由我校生化教研室首先利用削減雜交技術(shù)在人正常腦組織中克隆出的一個(gè)新基因(GenBank登錄號: AF159092)。研究發(fā)現(xiàn),它在腫瘤組織中呈現(xiàn)表達(dá)降低或不表達(dá)狀態(tài);因其具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖;促進(jìn)腫

4、瘤細(xì)胞的凋亡;抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲等作用,由此可說明該基因?yàn)橐灰职┗?。我們的研究還證實(shí),NDRG2可參與到多種應(yīng)激反應(yīng)的過程中。那么,NDRG2是否在熱應(yīng)激抗肝癌細(xì)胞侵襲中發(fā)揮作用呢?我們能否從 NDRG2入手去調(diào)控?zé)岑熆垢伟┘?xì)胞侵襲的信號通路呢?帶著這樣的疑問,我們進(jìn)行了NDRG2在熱療引發(fā)的熱應(yīng)激抗肝癌細(xì)胞侵襲作用中的功能及其機(jī)制研究。
　　研究方法和結(jié)果:
　　1.研究對比了不同溫度熱作用對肝癌細(xì)胞遷移能力及體外侵

5、襲能力的影響:將肝癌HepG-2和Huh-7細(xì)胞分別置于37℃、39℃、41℃、43℃、45℃水浴中熱作用30min后,通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力;侵襲小室(Transwell)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞體外侵襲能力。結(jié)果顯示:與37℃(對照組)相比,41℃、43℃、45℃組HepG-2和Huh-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力均有不同程度的降低,其中45℃組細(xì)胞遷移和侵襲能力下降尤其明顯(P<0.05)。
　　2.研究不同溫度熱作用對肝癌細(xì)胞內(nèi)

6、NDRG2、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)量的影響:將肝癌HepG-2和Huh-7細(xì)胞采用水浴加熱的方式行37℃、39℃、41℃、43℃、45℃熱作用30min后,通過Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測NDRG2、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)量。結(jié)果:與37℃(對照組)相比,經(jīng)45℃熱作用后肝癌HepG-2和Huh-7細(xì)胞的MMP-2及MMP-9分泌量明顯下降,同時(shí)伴隨細(xì)胞內(nèi)NDRG2的表達(dá)量明顯上升。
　　3.分析NDRG2在熱

7、應(yīng)激抗肝癌細(xì)胞侵襲中的生物學(xué)功能:
　　(1)構(gòu)建了NDRG2過表達(dá)和shRNA干涉的慢病毒載體,包裝慢病毒并進(jìn)行病毒滴度測定,感染肝癌HepG-2細(xì)胞后,利用載體攜帶的篩選標(biāo)記進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選,最后采用 Western-blot方法鑒定慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)后NDRG2蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)差異。
　　(2)應(yīng)用Transwell方法和Western-blot方法檢測了對照組,單熱處理組,NDRG2過表達(dá)組,及 NDRG2過表達(dá)聯(lián)合熱

8、處理組之間細(xì)胞侵襲力和細(xì)胞內(nèi) NDRG2、MMP-2、MMP-9的表達(dá)情況。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,給予NDRG2過表達(dá)的HepG-2細(xì)胞株45℃、30min熱處理后,細(xì)胞內(nèi)NDRG2的表達(dá)明顯增高,同時(shí)伴隨細(xì)胞侵襲力、MMP-2和MMP-9的表達(dá)明顯降低。
　　(3)建立裸鼠荷瘤模型,并給予移植瘤局部45℃的熱作用,之后通過 HE染色及免疫組化等實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)侵襲力及相應(yīng)的NDRG2、MMP-2及MMP

9、-9蛋白表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示,與對照組相比,45℃熱作用能有效抑制腫瘤對周圍肌肉組織的侵襲作用,而干涉腫瘤細(xì)胞內(nèi)NDRG2的表達(dá)則降低了熱對腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制作用。
　　4. NDRG2在熱療抗肝癌細(xì)胞侵襲中的分子機(jī)制研究:
　　(1)Western-blot方法檢測了45℃,30min熱作用后12h內(nèi)在空載體對照和NDRG2過表達(dá)的HepG-2細(xì)胞間HSP90,HSP70和HSP27蛋白的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示,熱作用后

10、的12h內(nèi)HSP27和HSP90在兩組之間的各時(shí)間點(diǎn)均未見顯著變化,而HSP70在熱作用后6h表達(dá)量開始升高,但在兩個(gè)組之間沒有顯著差異。
　　(2)Western-blot方法檢測了45℃,30min熱作用后12h內(nèi)在空載體對照和NDRG2過表達(dá)的HepG-2細(xì)胞間MAPK通路中ERK1/2、JNK、p38 MAPK總蛋白和磷酸化的表達(dá)變化情況。通過對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析,我們發(fā)現(xiàn)對照組的HepG-2細(xì)胞在給予熱處理后的2h之內(nèi),ER

11、K1/2的磷酸化水平開始增加,在熱處理后的4h又迅速的回降到基礎(chǔ)水平,甚至到后面的時(shí)間磷酸化水平降得更低;可是NDRG2的過表達(dá)不僅降低了 HepG-2細(xì)胞中 ERK1/2的本底水平,還降低了熱作用早期對ERK1/2的誘導(dǎo);然而,在以上的整個(gè)過程中JNK和p38MAPK總蛋白和磷酸化的表達(dá)水平在對照和NDRG2過表達(dá)的HepG-2細(xì)胞間并沒有發(fā)生顯著性變化。(3)為了進(jìn)一步驗(yàn)證上一實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們分別應(yīng)用 ERK1/2,p38MAPK和

12、JNK三個(gè)激酶的抑制劑 PD98059、SB203580和 SP600125作用于 NDRG2被敲除的HepG-2細(xì)胞,經(jīng)過45℃,30min熱處理后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)也只有加了PD98059(ERK1/2的抑制劑)組可以明顯抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)。
　　5.比對NDRG2聯(lián)合熱應(yīng)激對肝癌細(xì)胞治療的效果:
　　(1)應(yīng)用Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測37℃,43℃和45℃熱處理后的細(xì)胞凋亡情況,結(jié)

13、果顯示,空載體對照的HepG-2細(xì)胞的凋亡率會(huì)隨著加熱溫度的增加而增加,于此同時(shí)伴隨著壞死率的增加。然而,給予 NDRG2過表達(dá)的HepG-2細(xì)胞43℃的熱處理,細(xì)胞的凋亡率可高達(dá)45℃熱作用于空載體對照組的水平,而細(xì)胞壞死率卻沒有隨之增加。
　　(2)我們近一步應(yīng)用 Transwell法和 Western-blot法檢測了37℃,43℃和45℃熱處理后的細(xì)胞侵襲情況,空載體對照的HepG-2細(xì)胞的侵襲能力和 MMP-2、MMP-

14、9蛋白的表達(dá)會(huì)隨著溫度的增加而降低,其中在45℃時(shí)這種變化最為顯著。然而在給予NDRG2過表達(dá)的HepG-2細(xì)胞43℃的熱作用時(shí),細(xì)胞的侵襲能力和MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)顯著降低的變化,并可達(dá)到空載體對照組45℃的水平。
　　結(jié)論:
　　1.45℃的熱作用可明顯抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　2. NDRG2參與了熱應(yīng)激抑制肝癌細(xì)胞侵襲的作用,并且熱應(yīng)激所誘導(dǎo)NDRG2的表達(dá)量變化與肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移