NDRG2、TGF-β1在腎纖維化過程中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　?。ㄒ唬┓謩e采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western Blotting法檢測(cè)NDRG2在不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞系的表達(dá)水平。
　?。ǘ?gòu)建三種NDRG2誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞亞系及其對(duì)照組，采用WesternBlotting法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)EMT標(biāo)記物在不同HK-2細(xì)胞亞系中的蛋白和mRNA的表達(dá)水平;采用ELISA法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)在不同HK-2細(xì)胞亞系中細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)水平。

2、
　?。ㄈ?gòu)建三種NDRG2誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞亞系及其對(duì)照組，采用WesternBlotting法檢測(cè)Smad2(p-Smad2)、Smad3(p-Smad3)及Smad7在不同細(xì)胞亞系中的表達(dá)水平;采用Western Blotting法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)在NDRG2-siRNA+SIS3(SelleckChem)作用下EMT標(biāo)記物的蛋白和mRNA的表達(dá)水平及ELISA法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)水平。<

3、br>　　材料與方法：
　　將不同濃度的TGF-β1(0ng/ml、2.5ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml)分別加入到HK-2細(xì)胞系中，分別進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)48h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western Blotting法檢測(cè)NDRG2在不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞系中的表達(dá)水平。建立三種NDRG2誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞亞系及其對(duì)照組，采用Western Blotting法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

4、檢測(cè)EMT標(biāo)記物在不同HK-2細(xì)胞亞系中的蛋白和mRNA的表達(dá)水平;采用ELISA法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)在不同HK-2細(xì)胞亞系中細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)水平。建立三種NDRG2誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞亞系，采用Western Blotting法檢測(cè)Smad2(p-Smad2)、 Smad3(p-Smad3)及Smad7(p-Smad7)在不同細(xì)胞亞系中的表達(dá)水平;采用Western Blotting法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)在NDRG2-si

5、RNA+ SIS3(SelleckChem)作用下EMT標(biāo)記物的蛋白和mRNA的表達(dá)水平及ELISA法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬㎞DRG2在不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞系中的表達(dá)及意義
　　1.RT-PCR法檢測(cè)NDRG2在不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞系中mRNA的表達(dá)水平:NDRG2在A1(0ng/ml TGF-β1)、B1(2.5ng/ml TGF-

6、β1)、C1(5ng/mlTGF-β1)、D1(10ng/ml TGF-β1)、E1(20ng/ml TGF-β1)HK-2細(xì)胞亞系中的mRNA表達(dá)水平依次降低;B1組、C1組、D1組及E1組與A1組相比較P值分別為0.012、0.011、0.003、0.016，C1組與B1組相比較P=0.031，D1組與C1組相比較P=0.013，E1組與D1組相比較P=0.013，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.Western blot法檢測(cè)

7、NDRG2在不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞系中蛋白的表達(dá)水平:NDRG2在A2(0ng/ml TGF-β1)、B2(2.5ng/ml TGF-β1)、C2(5ng/mlTGF-β1)、D2(10ng/ml TGF-β1)、E2(20ng/ml TGF-β1)HK-2細(xì)胞亞系中的蛋白表達(dá)水平依次降低;B2組、C2組、D2組及E2組與A2組相比較P值分別為0.011、0.001、0.004、0.017，C2組與B2組相比較P=0.0

8、21，D2組與C2組相比較P=0.014，E2組與D2組相比較P=0.003，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。ǘ㎞DRG2和TGF-β1對(duì)EMT標(biāo)記物及細(xì)胞外基質(zhì)的影響及意義
　　1.通過細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建TGF-β1+pcDNA3.1-NDRG2 HK-2細(xì)胞亞系及其對(duì)照組TGF-β1+pc-control、TGF-β1+NDRG2-siRNA HK-2細(xì)胞亞系及其對(duì)照組TGF-β1+si-NC、TGF-β1 HK-2

9、細(xì)胞亞系及其對(duì)照組control，然后通過CellCounting Kit-8(CCK-8)法檢測(cè)各HK-2細(xì)胞亞系中細(xì)胞活性，結(jié)果各HK-2細(xì)胞亞系與其對(duì)照組相比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明各細(xì)胞系的細(xì)胞活力均不受pcDNA3.1-NDRG2、NDRG2-siRN、TGF-β1及相應(yīng)對(duì)照劑的影響。
　　2.Western blot法檢測(cè)NDRG2在接受pcDNA3.1-NDRG2、NDRG2-siRN轉(zhuǎn)染的HK-2

10、細(xì)胞亞系中蛋白表達(dá)水平:NDRG2在只含有TGF-β1(B1組/B2組)的HK-2細(xì)胞亞系中的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組control(A1組/A2組)相比較明顯降低(P=0.011;P=0.009); NDRG2在接受pcDNA3.1-NDRG2(D1組)轉(zhuǎn)染的HK-2細(xì)胞亞系中的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組pc-control(C1組)相比較明顯升高(P=0.024); NDRG2在接受NDRG2-siRNA(F1組)轉(zhuǎn)染的HK-2細(xì)胞亞系中的相對(duì)表

11、達(dá)量與及對(duì)照組si-NC(E1組)相比較明顯降低(P=0.001）;上述差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。ㄈ㎞DRG2和TGF-β1在HK-2細(xì)胞系中對(duì)Smad表達(dá)的影響及意義
　　Western blot法檢測(cè)Smad2(p-Smad2)、Smad3(p-Smad3)及Smad7在接受pcDNA3.1-NDRG2、NDRG2-siRN轉(zhuǎn)染的HK-2細(xì)胞亞系中蛋白表達(dá)水平:t-Smad2及p-Smad2（磷酸化）在B1組(TG

12、F-β1)的蛋白表達(dá)水平比對(duì)照組A1組(control)均明顯上升(P=0.003、P=0.012)，而在D1組(pcDNA3.1-NDRG2)及F1組(NDRG2-siRNA)分別與其對(duì)照組C1組(pc-control)、E1組(si-NC)相比其蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯差異(P=0.067及P=0.054、P=0.053及P=0.102); t-Smad3及p-Smad3在在B1組(TGF-β1)的蛋白表達(dá)水平比對(duì)照組A1組(contro

13、l)明顯上升(P=0.005、P=0.021），t-Smad3在D1組(pcDNA3.1-NDRG2)及F1組(NDRG2-siRNA)分別與其對(duì)照組C1組(pc-control)、E1組(si-NC)相比其蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯差異(P=0.112、P=0.215)，p-Smad3在D1組(pcDNA3.1-NDRG2)與其對(duì)照組C1組(pc-control)相比其蛋白表達(dá)量明顯降低(P=0.002)，而在F1組(NDRG2-siRNA)

14、與其對(duì)照組E1組(si-NC)相比其蛋白表達(dá)量明顯升高(P=0.031);Smad7在B1組(TGF-β1)的蛋白表達(dá)水平比對(duì)照組A1組(control)均明顯降低(P=0.011)，而在D1組(pcDNA3.1-NDRG2)及F1組(NDRG2-siRNA)分別與其對(duì)照組C1組(pc-control)、E1組(si-NC)相比其蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯差異(P=0.098及P=0.154、P=0.353及P=0.202)。上述差異均具有統(tǒng)計(jì)

15、學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　NDRG2調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞纖維化的作用，且可能是通過TGF-β1/Smad3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　（一）NDRG2的mRNA和蛋白表達(dá)水平在不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中以劑量依賴性方式下調(diào)，特別是TGF-β1(＞10ng/mL)，其作用最大（P＜0.05）。這些結(jié)果表明HK-2細(xì)胞中TGF-β1下調(diào)NDRG2 mRNA和蛋白表達(dá)，表明其可能對(duì)腎纖維化的抑制基因起調(diào)

16、控作用。
　?。ǘ└鶕?jù)E-cadherin、a-SMA、Vimentin、Snail在不同HK-2細(xì)胞亞系中的mRNA和蛋白的表達(dá)情況，揭示了在mRNA和蛋白水平，E-cadherin在只含有TGF-β1的HK-2細(xì)胞亞系及NDRG2-siRNA HK-2細(xì)胞亞系中表達(dá)量降低，在pcDNA3.1-NDRG2 HK-2細(xì)胞亞系中過表達(dá)，a-SMA、Vimentin、Snail在只含有TGF-β1的HK-2細(xì)胞亞系及NDRG2-si

17、RNA HK-2細(xì)胞亞系中過表達(dá)，而在pcDNA3.1-NDRG2 HK-2細(xì)胞亞系中表達(dá)量降低，表明NDRG2調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中EMT標(biāo)記物的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)，在EMT過程中NDRG2/TGF-β1存在潛在的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　?。ㄈ└鶕?jù)COI-Ⅰ、COI-Ⅲ、FN在不同HK-2細(xì)胞亞系中的蛋白和mRNA的表達(dá)水平，揭示了在mRNA和蛋白水平，COI-Ⅰ、COI-Ⅲ、FN在只含有TGF-β1的HK-2細(xì)胞亞系及