DPSCs和PRF在犬年輕恒牙牙髓血管再生術(shù)中的應(yīng)用.pdf

1、目的：本研究通過構(gòu)建犬年輕恒牙慢性根尖周炎（chronic apical periodontitis，CAP）模型，使用改良的三聯(lián)抗生素糊劑行根管消毒后刺激根尖出血，添加自體牙髓干細(xì)胞和富血小板纖維蛋白，并通過影像學(xué)、機(jī)械力學(xué)、組織學(xué)檢測(cè)探究根管內(nèi)新生組織的構(gòu)成，以及通過添加不同的因子，探討改進(jìn)該法的可能性。
　　方法：健康6月齡Beagle犬4只，選擇雙側(cè)上頜第3切牙作為DPSCs（dental pulp stem cells）

2、來源，采用并改良Gronthos等報(bào)道的方法進(jìn)行Beagle犬原代cDPSCs的分離、培養(yǎng)，并進(jìn)行表型鑒定及GFP（green fluorescent protein）基因的轉(zhuǎn)染。參照Choukroun的方法制備自體PRF（platelet-rich fibrin）。每只犬上頜雙側(cè)第2、3前磨牙，下頜雙側(cè)第2、3、4前磨牙作為實(shí)驗(yàn)牙，成功建立CAP模型后采用改良的三聯(lián)抗生素糊劑進(jìn)行根管消毒。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和4組實(shí)驗(yàn)組，A組：bloo

3、d clot組，B組：PRF組，C組：cDPSCs組，D組：PRF+cDPSCs組。在刺激根尖出血的基礎(chǔ)上添加cDPSCs和PRF，并用MTA（mineral trioxide aggregate）與復(fù)合樹脂封閉冠部。3個(gè)月后，采用平行投照的方法拍攝根尖X線片，觀察CAP的愈合情況，并通過Image J軟件測(cè)量術(shù)前術(shù)后牙根長度和管壁厚度的變化；使用萬能材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)量實(shí)驗(yàn)牙的抗折強(qiáng)度，通過與正常牙的對(duì)比，評(píng)估該法對(duì)恢復(fù)牙齒抗折強(qiáng)度的效果；

4、通過對(duì)實(shí)驗(yàn)牙進(jìn)行HE染色，探明根管內(nèi)新生組織的組成成分及來源。
　　結(jié)果：
　?。?）cDPSCs分離、培養(yǎng)、鑒定結(jié)果：Beagle犬牙髓組織分離3 d后可觀察到cDPSCs貼壁生長。cDPSCs的增殖曲線符合細(xì)胞對(duì)數(shù)生長曲線。細(xì)胞表面標(biāo)記物 CD146、STRO-1和Vimentin檢測(cè)均表達(dá)陽性。
　?。?）cDPSCs多向分化誘導(dǎo)結(jié)果：cDPSCs的成牙本質(zhì)/骨分化誘導(dǎo)，茜素紅染色呈強(qiáng)陽性，可見有大量暗紅色礦化結(jié)

5、節(jié)散在分布。cDPSCs的成脂分化誘導(dǎo)，油紅O染色陽性，可見暗紅色圓形油脂滴，呈串珠狀。
　?。?）GFP基因轉(zhuǎn)染結(jié)果：GFP轉(zhuǎn)染48 h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率已達(dá)到80％～90%，但與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長增殖速率有所減緩，且形態(tài)發(fā)生一定的改變。
　?。?）改良的TAP（triple antibiotic paste）根管消毒結(jié)果：TAP消毒3 W后，38顆實(shí)驗(yàn)牙仍有3顆炎癥未控制。根管沖洗液進(jìn)行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)，在需氧條

6、件下均無菌落形成，而在厭氧環(huán)境中，有一個(gè)根管來源的培養(yǎng)基出現(xiàn)白色菌落，革蘭氏染色呈紅色。
　?。?）根尖X線片結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組都出現(xiàn)了根尖暗影愈合，根尖閉合趨勢(shì)，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01）。
　?。?）Image J軟件測(cè)量結(jié)果：在牙根增加長度、管壁增加厚度上，4組實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間存在顯著性差異（P<0.01），實(shí)驗(yàn)組均低于對(duì)照組，各實(shí)驗(yàn)組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01）。
　　（7）抗折強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果：4組實(shí)驗(yàn)

7、組與對(duì)照組間存在顯著性差異（P<0.01），4組實(shí)驗(yàn)組的折裂力值均低于對(duì)照組。B組、C組、D組與A組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01）。
　?。?）HE染色結(jié)果：實(shí)驗(yàn)牙根管內(nèi)均有血管、類牙骨質(zhì)、類骨以及類牙周膜等組織生成，但未發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)的形成。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組在根管內(nèi)新生物的組成和數(shù)量上無差別。熒光顯微鏡下未發(fā)現(xiàn)有綠色熒光的組織或細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　?。?）采用并改良 Gronthos等的方法分離、培養(yǎng) cDPSCs具有

8、很強(qiáng)的自我增殖能力和多向分化能力；
　?。?）改良的TAP首次運(yùn)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)感染根管有良好的消毒作用；
　　（3）首次運(yùn)用慢病毒載體介導(dǎo)GFP基因轉(zhuǎn)染cDPSCs的方法并不適用于牙髓血管再生術(shù)中新生組織來源的研究；
　　（4）在傳統(tǒng)牙髓血管再生術(shù)刺激根尖出血的基礎(chǔ)上添加自體PRF和cDPSCs3個(gè)月后，證實(shí)了根管內(nèi)的新生物的構(gòu)成仍主要是類牙骨質(zhì)、類骨及類牙周膜等組織，未發(fā)現(xiàn)有牙本質(zhì)的形成；牙抗折強(qiáng)度恢復(fù)到正常水平