無基礎(chǔ)疾病的肺隱球菌病患者細(xì)胞免疫功能變化及其機(jī)理探討.pdf

1、研究背景及目的：
　　肺隱球菌?。≒ulmonary Cryptococcosis PC）是由新型隱球菌感染引起的一種肺真菌病。新型隱球菌是一種條件致病菌，其孢子可隨塵埃被吸入呼吸道內(nèi)而引起呼吸道感染。PC是常見的機(jī)會(huì)性感染，特別是在免疫功能低下者，如AIDS、器官移植等患者。近年來，PC的病例報(bào)告有增加的趨勢，也常見于無基礎(chǔ)疾病及免疫缺陷的中年人。這類患者癥狀多不明顯，常在體檢中被發(fā)現(xiàn)，更易被漏診、誤診，宿主免疫功能降低時(shí)易播散

2、，甚至可引起嚴(yán)重的隱球菌性腦膜炎，治療難度大，是世界范圍內(nèi)影響人類健康的疾病。
　　新型隱球菌的清除主要取決于宿主的免疫功能狀態(tài)以及對感染所起的防御反應(yīng)。宿主抵抗隱球菌感染主要通過IL-12/IFN-γ途徑激活的Th1的保護(hù)性細(xì)胞免疫和巨噬細(xì)胞的吞噬清除。無基礎(chǔ)疾病的人群，吸入新型隱球菌孢子后，宿主啟動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)機(jī)體對新型隱球菌的易感性和抵抗力以有效清除新型隱球菌。而對于AIDS患者，由于HIV感染導(dǎo)致宿主CD4+T淋巴

3、細(xì)胞減少或缺乏，機(jī)體免疫功能抑制或低下，細(xì)胞免疫從Th1向Th2失衡，妨礙了隱球菌的清除，表現(xiàn)為患病。另一方面，新型隱球菌也能影響T淋巴細(xì)胞的活化、分化及存活，干擾Th1的分化和促進(jìn)Th2的非保護(hù)性作用，從而影響機(jī)體的免疫功能。新型隱球菌感染宿主后，與宿主相互作用，改變其免疫狀態(tài)，逃避宿主細(xì)胞免疫的清除作用，這可能解釋新型隱球菌感染長期潛伏以及無基礎(chǔ)疾病患者患病的原因。因此，研究無基礎(chǔ)疾病的PC患者的細(xì)胞免疫功能變化，探討其機(jī)理對PC的

4、防治具有非常重要的意義。
　　本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）的方法來測定分析PC患者和健康對照組血清IL-12、IFN-γ和IL-4分泌水平的差異，為闡明無基礎(chǔ)疾病的PC患者的細(xì)胞免疫功能變化提供線索。同時(shí)，通過觀察IL-12對PC患者及健康對照組外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）IFN-γ

5、和IL-4釋放的影響，了解無基礎(chǔ)疾病的PC患者IL-12/ IFN-γ等細(xì)胞因子的相互影響，初步探討無基礎(chǔ)疾病PC患者中新型隱球菌長期潛伏以及逃逸宿主細(xì)胞免疫的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、樣本收集處理：收集無基礎(chǔ)疾病PC的患者20例，健康對照組20例。抽取無菌肝素抗凝靜脈血10ml，低速（2500rpm）離心分離血清，分裝，低溫（-80℃）保存。應(yīng)用ELISA法檢測IL-12、IFN-γ和IL-4。
　　2、PBM

6、C分離培養(yǎng)及上清液細(xì)胞因子測定：低速離心（2500rpm）后，應(yīng)用微量移液器將上層血清分裝于1.5ml干凈無菌EP管中，-80℃冰箱備用；下層細(xì)胞中加入適量淋巴細(xì)胞分離液，常規(guī)分離 PBMC，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1x10^6/ml,植入24孔培養(yǎng)板，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱箱孵育，按加入刺激物的不同分為兩組：
　　RPMI1640空白對照組，rhIL-12(20 ng/ ml)組,終體積均為1

7、ml,復(fù)孔對照。培養(yǎng)48h后，離心棄沉淀后收集上清液，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用ELISA法測定IFN-γ、IL-4。
　　結(jié)果：
　　1、PC組血清IL-12、IFN-γ和IL-4濃度的變化：
　　PC組和健康對照組血清 IL-12、IFN-γ和IL-4濃度分別為（2.514±0.54pg/ml）vs（2.517±0.58pg/ml），（14.52±2.71pg/ml）vs（81.80±9.84pg/ml），（6

8、.90±1.25pg/ml）vs（7.31±1.47pg/ml）。經(jīng)檢驗(yàn)，PC患者血清IFN-γ水平明顯低于正常對照組(P<0.01)，而兩組之間IL-12和IL-4的平均濃度無顯著性差異（P>0.05）。
　　2、PC組PBMC上清液IFN-γ和IL-4濃度的變化：
　　PC組和健康對照組上清液在加入rhIL-12前IFN-γ和IL-4濃度分別為（55.69±13.61pg/ml） vs（51.13±17.54pg/ml）

9、，（5.056±0.6785pg/ml）vs（5.025±0.6403pg/ml），兩組之間IFN-γ和IL-4的平均濃度無顯著性差異（P>0.05）。
　　3、PC組細(xì)胞免疫功能的變化
　　PC組和健康對照組上清液IFN-γ、IL-4的平均濃度加入rhIL-12刺激后增加的倍數(shù)分別為：（4.3±0.5倍）vs（7.9±1.1倍），（0.86±0.43倍）vs（1.27±0.35倍）。經(jīng)檢驗(yàn)，PC組上清液IFN-γ平均濃度增