三氧化二砷免疫毫微球靶向治療膀胱腫瘤的研究.pdf

1、【目的】制備單抗BDI-1導向的三氧化二砷免疫蛋白微球[As2O3-(BSA-NS)-BDI-1]并驗證其對膀胱腫瘤細胞的特異性結合和殺傷作用，以最大程度減輕As2O3毒副作用，實現(xiàn)其導向化療。 【方法】1、通過交聯(lián)固化的方法制備三氧化二砷白蛋白微球(As2O3-BSA-NS)，按正交設計優(yōu)化制備工藝。電鏡觀察、原子熒光分析的方法評價微球質量，體外釋藥方法研究其釋藥特性。2、采用雜交瘤細胞BDI-1腹腔種植的方法制備單克隆抗體B

2、DI-1并采用親和層析的方法純化抗體。免疫熒光的方法鑒定抗體活性并測量其效價。通過N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸脂(SPDP)交聯(lián)的方法制備蛋白免疫微球，還原電泳、光鏡和電鏡的方法鑒定As2O3免疫微球的共價連接與活性，吖啶橙染色檢測腫瘤細胞凋亡。3、3氫-胸腺嘧啶核苷(3H-TDR)摻入法檢測As2O3-(BSA-NS)-BDI-1的細胞殺傷活性，流式細胞計數(shù)法測定細胞凋亡。4、通過BIU-87細胞種植的方法建立裸

3、鼠膀胱腫瘤的原位模型，經尿道置套管針膀胱灌注給藥。觀察小鼠一般情況并記錄生存時間，解剖顯微鏡和膀胱腫瘤石蠟切片染色觀察膀胱腫瘤生長和浸潤情況及各器官毒性反應。原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)檢測腫瘤細胞凋亡情況。 【結果】1、確定As2O3-BSA-NS制備工藝的最佳組合為A4B3C2D4，其DF值為0.76534。電鏡觀察進一步證實制備的As2O3-NS形狀規(guī)則、大小合適，體外釋藥實驗證實As2O3蛋白微球釋藥速度明顯慢于

4、單純的As2O3。2、所制備抗體純度較高，其效價達1：20，000，紫外分光光度計分析抗體濃度達5mg/ml，SDS-PAGE還原電泳可見免疫微球被還原后在遠端形成兩條蛋白條帶。光鏡下可見蛋白免疫微球在腫瘤細胞周圍并隨細胞移動。電鏡下可見蛋白微球與腫瘤細胞緊密連接且形態(tài)完整。吖啶橙染色可見免疫微球處理的膀胱腫瘤細胞表現(xiàn)出凋亡特征。3、As2O3-(BSA-NS)-BDI-1殺傷膀胱腫瘤細胞的效果明顯好于As2O3-BSA-NS和As2O

5、3(P＜0.05)。AnnexinV-PI染色流式細胞分析顯示膀胱腫瘤細胞被誘導凋亡，免疫蛋白微球的誘導效果明顯好于蛋白微球和As2O3(P＜0.05)。4、成功建立小鼠膀胱腫瘤原位模型，顯微鏡及石蠟切片觀察到膀胱灌注As2O3-(BSA-NS)-BDI-1組腫瘤生長及向周圍浸潤受到明顯抑制(95.2％)，且各器官毒性反應明顯較灌注As2O3輕。As2O3-(BSA-NS)-BDI-1組小鼠膀胱腫瘤細胞凋亡率明顯高于其他組(P＜0.05