鹽酸埃克替尼對人胃癌SNu-1細(xì)胞增殖抑制作用的研究.pdf

1、目的:胃癌全球發(fā)病率在腫瘤中位列第4位，死亡率位列第2位，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。從患病人數(shù)來看，我國胃癌患者數(shù)占全球發(fā)病總數(shù)的47％左右。目前手術(shù)仍是治療胃癌的主要手段，結(jié)合術(shù)前或術(shù)后的輔助治療，但進(jìn)展期胃癌預(yù)后仍然較差，聯(lián)合化療的中位總生存一直停滯在10～11個(gè)月。因此胃癌的內(nèi)科治療仍十分棘手，現(xiàn)行治療方案遠(yuǎn)不能讓人滿意。
　　 表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是1種受

2、體酪氨酸激酶，EGFR基因的表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，這種表達(dá)異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞增殖，遷移，侵襲，轉(zhuǎn)移，血管生成和抑制細(xì)胞凋亡。最近的研究報(bào)道，EGFR在正常胃黏膜中無表達(dá)或低表達(dá)，在胃癌組織中高表達(dá)，EGFR與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年來隨著對胃癌分子生物學(xué)研究的不斷深入，分子靶向治療應(yīng)運(yùn)而生。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitor

3、，EGFR-TKI)的研究非?；钴S。新一代EGFR-TKI鹽酸?？颂婺?icotinibhydrochloride，商品名CONMANATM，克美納TM)是中國首個(gè)自主研制的小分子靶向新藥，并已獲得國際認(rèn)可。研究數(shù)據(jù)表明其在體外可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長，如A431細(xì)胞株、人肺腺癌A549細(xì)胞株、舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞株等。本實(shí)驗(yàn)以人胃癌SNU-1細(xì)胞為研究對象，探討鹽酸?？颂婺釋?xì)胞的增殖抑制的作用，并檢測其下游信號通路，初步探討

4、其內(nèi)在作用機(jī)制，為胃癌的靶向治療提供新的思路。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培育:常規(guī)復(fù)蘇凍存的人胃癌SNU-1細(xì)胞，接種于100ml培養(yǎng)瓶中，在含10％胎牛血清，100U/ml的青霉素及鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 2.應(yīng)用MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-zyl)-5-(3-carboxymethoxypheny

5、l)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazoliuzolium，innersalt]比色法檢測鹽酸?？颂婺釋θ宋赴㏒NU-1細(xì)胞的增殖情況，繪制細(xì)胞生長抑制率曲線。
　　 3.采用流式細(xì)胞術(shù)(Flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測鹽酸?？颂婺釋θ宋赴㏒NU-1細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡的影響:將濃度為2.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種于100ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度(0、5、10、20、40、

6、80μmol/L)的鹽酸?？颂婺?，對照組加入等量的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，70％的冷乙醇固定，PI(50μg/ml)0.5ml避光染色后，置流式細(xì)胞儀（美國BeckmanCoulter公司生產(chǎn)）分析。
　　 4.運(yùn)用Westernblot法檢測EGFR下游信號通路中相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化Akt、細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)情況。
　　 5.所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以(x)±s

7、表示，多組比較時(shí)，方差齊者，采用單因素的方差分析，組間多重比較用SNK法。P＜0.05表示有顯著性差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTS法檢測細(xì)胞增殖活性:同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度(5、10、20、40、80μmol/L)的鹽酸埃克替尼分別作用于人胃癌SNU-1細(xì)胞株后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，隨著濃度的增大，吸光度值明顯減小，增殖抑制率明顯提高，各濃度間抑制率差異顯著(P＜0.05);同一濃度鹽酸?？颂婺嵩诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)(24h、

8、48h、72h)對人胃癌SNU-1細(xì)胞的抑制作用，隨時(shí)間延長而增強(qiáng)(P＜0.05)?？傊?，鹽酸埃克替尼對人胃癌SNU-1細(xì)胞的生長抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞凋亡和周期的分布情況:經(jīng)FCM檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度（0、5、10、20、40、80μmol/L）鹽酸?？颂婺嶙饔?8h后，細(xì)胞的凋亡率分別為:（1.9004±0.361）％，(8.467±0.961)％，(14.267±3.702)％,

9、(20.813±3.260)％,(26.533±3.102)％,(32.200±4.900)％，均顯著高于對照組，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。細(xì)胞分布于G0/G1期的比率分別為:(11.667±2.173)％，(20.200±2.955)％,(28.467±5.380)％,(37.567±4.219)％,(46.000±4.321)％，(56.367±6.526)％;細(xì)胞分布于S期的比率分別為:(57.467±7

10、.358)％,(48.900±4.590)％,(40.267±3.201)％,(31.700±2.052)％,(23.200±5.112)％，(14.567±2.581)％;細(xì)胞分布于G2/M期的比率分別為:(23.067±3.553)％,(21.767±2.669)％,(23.567±3.478)％,(14.167±2.793)％，(17.900±1.609)％，(10.833±1.550)％。各實(shí)驗(yàn)組較對照組均出現(xiàn)G0/G1期細(xì)胞比

11、率增高與S期細(xì)胞比率下降，差異有顯著性意義(P＜0.05)，而G2/M期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 3Westernblot法檢測結(jié)果:與空白對照組相比，鹽酸埃克替尼能明顯下調(diào)p-Akt、CyclinD1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.鹽酸?？颂婺崮芤种迫宋赴㏒NU-1細(xì)胞株的增殖，其抑制作用具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。
　　 2.鹽酸?？颂婺崮芨淖?nèi)宋赴㏒NU-1細(xì)胞株的細(xì)胞周期