與自閉癥易感基因存在作用的miRNAs的篩選與研究.pdf

1、自閉癥是一種由于神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)導(dǎo)致的發(fā)育障礙，致病原因尚不明確，但繁多的自閉癥候選基因提示其是一種多基因遺傳病，即在一定的遺傳傾向性下，由環(huán)境致病因子誘發(fā)。
　　MicroRNA(miRNA)作為一類具有組織和時(shí)間特異性表達(dá)的小RNA分子，通過與靶標(biāo)基因的mRNA特異性堿基配對，導(dǎo)致其降解或者抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對靶標(biāo)基因精確調(diào)控。在神經(jīng)系統(tǒng)中，miRNA參與中樞發(fā)育、神經(jīng)元分化和突觸塑形等過程，通過對突觸可塑性的調(diào)節(jié)參與形

2、成學(xué)習(xí)記憶。
　　結(jié)合miRNA的調(diào)控特點(diǎn)和在神經(jīng)系統(tǒng)中的重要作用，本文以搜集和確定自閉癥易感基因?yàn)槠瘘c(diǎn)，以果蠅作為模式動物，篩選能夠調(diào)控自閉癥易感基因的miRNAs，并進(jìn)一步研究候選miRNAs與自閉癥易感基因之間的關(guān)系，以及候選miRNAs在果蠅神經(jīng)系統(tǒng)中的功能。
　　首先，搜集整理已有明確報(bào)道的自閉癥易感基因。在對一組多元化自閉癥家族中50萬個(gè)SNP（單核苷酸多態(tài)性）全基因組掃描中，研究者發(fā)現(xiàn)，5號染色體上SEMA5A

3、的表達(dá)在自閉癥患者腦中明顯減少。位于人類第22號染色體上的SHANK3基因，是主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄合成突觸后膜上的腳手架蛋白;同時(shí)，在突觸形成以及樹突棘的成熟上，它也具有一定的作用;SHANK3一般作用于谷氨酸能突觸，SHANK3會影響突觸，而自閉癥癥候群的發(fā)病機(jī)制，很可能是因?yàn)榛蛉毕萦绊懲挥|功能所致。對7號染色體上某些基因變異與自閉癥的關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果顯示，自閉癥與基因CNTNAP2顯著相關(guān)，而CNTNAP2在涉及語言和思維的大腦區(qū)域最為活躍

4、;大腦發(fā)育基因表達(dá)分析顯示，在語言發(fā)育的重要回路中存在豐富的CNTNAP2。結(jié)合果蠅基因同源性比較結(jié)果，最終確定SEMA5A、SHANK3、CNTNAP2作為本文的研究對象，其在果蠅中的同源基因分別為Sema-5c、ProSAP、Nrx-Ⅳ。
　　其次，利用生物信息學(xué)軟件，分別預(yù)測了11個(gè)與Sema-5c的3'UTR（非翻譯區(qū)）可能存在相互作用的miRNAs，30個(gè)與ProSAP的3'UTR可能存在相互作用的miRNAs，12個(gè)與

5、Nrx-Ⅳ的3'UTR可能存在相互作用的miRNAs;分別選擇了配對性較高的miRNAs，構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒，通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)在果蠅S2細(xì)胞水平進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示miR-34靶向作用于三類基因的效果最為明顯。
　　第三，利用原位雜交技術(shù)檢測出相關(guān)基因在果蠅胚胎期均有表達(dá)，神經(jīng)系統(tǒng)中尤為明顯。同時(shí)，RT-PCR和原位雜交的結(jié)果顯示miR-34的表達(dá)具有明顯的階段特異性，在胚胎與蛹期表達(dá)量極微，而在幼蟲與成蟲期表達(dá)量十分明顯。