Morpholino下調(diào)自閉癥基因方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、目的：2014年美國疾病控制和預(yù)防中心公布的數(shù)據(jù)顯示，每68名美國兒童中有1名自閉癥患者。自閉癥兒童比例約為1.5％，比2012年公布的數(shù)據(jù)高出近30%。研究發(fā)現(xiàn)自閉癥是源于易感基因和環(huán)境危險(xiǎn)因素之間的相互作用。許多在環(huán)境介質(zhì)、動(dòng)植物和人體中高檢出的環(huán)境污染物（如持久性有機(jī)物、重金屬和農(nóng)藥等）都具有顯著的神經(jīng)毒性，并與近期自閉癥患者的快速增長密切相關(guān)。
　　方法：首先選擇丙戊酸鈉(sodium valproate,VPA)作為評(píng)價(jià)

2、斑馬魚自閉癥的陽性化合物，以 VPA暴露斑馬魚所產(chǎn)生的一些表觀現(xiàn)象，作為評(píng)價(jià)斑馬魚自閉癥模型的指標(biāo)。接著選取了斑馬魚16號(hào)染色體上的基因，用單細(xì)胞期注射反義寡核苷酸（Morpholino,MO）的方法對(duì)候選基因進(jìn)行基因下調(diào)，再對(duì)其進(jìn)行發(fā)育毒性和自閉癥譜系障礙（ASD）風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，從中選取了兩個(gè)效果較好的基因和 BPA聯(lián)合，研究兩者的協(xié)同作用。將親本對(duì)照組的斑馬魚與雙酚 A（Bisphenol A,BPA）暴露的斑馬魚進(jìn)行交叉配對(duì)實(shí)

3、驗(yàn)，通過對(duì)其子代斑馬魚的發(fā)育毒性和神經(jīng)毒性的檢測(cè)來評(píng)價(jià)BPA慢性暴露對(duì)斑馬魚的影響。
　　結(jié)果：通過不同濃度的VPA暴露對(duì)斑馬魚畸形率、自主運(yùn)動(dòng)和頭部大小的研究發(fā)現(xiàn)，5μM VPA暴露胚胎，可使24 hpf自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)顯著升高，頭部顯著增大，故5μM為合適的用于后續(xù)ASD相關(guān)行為學(xué)的暴露濃度。用單細(xì)胞期注射MO的方法對(duì)候選基因進(jìn)行下調(diào)，再對(duì)其進(jìn)行發(fā)育毒性和ASD風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，選取了kctd13和chd8作為后期實(shí)驗(yàn)的候選基因，

4、并且確定了兩者的濃度分別是0.1 mM、0.25 mM；將這兩個(gè)候選基因下調(diào)分別急性暴露BPA，發(fā)現(xiàn)基因和BPA聯(lián)合處理對(duì)斑馬魚自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)的增加和增大頭部尺寸具有協(xié)同作用。低劑量BPA暴露對(duì)斑馬魚的生長發(fā)育基本沒有影響，但能導(dǎo)致F2代斑馬魚仔魚的頭部變大；成體雄魚腦部重量的增加；腦部ASD相關(guān)基因和wnt相關(guān)基因的qRT-PCR結(jié)果顯kctd13和chd8表達(dá)下調(diào)，作為wnt信號(hào)的負(fù)調(diào)控子，chd8下調(diào)激活了wnt信號(hào)通路，使mag、