RAPD標(biāo)記技術(shù)及rDNA ITS序列分析對(duì)蒲公英的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：研究河南蒲公英屬植物的親緣關(guān)系與遺傳多樣性,為蒲公英屬植物的品種鑒別、分類、優(yōu)良品種的選育及其品質(zhì)評(píng)價(jià)提供分子依據(jù)。
　　方法：(1)分別采用改良的CTAB、SDS、高鹽低pH三種提取方法及液氮、玻璃砂兩種研磨方法提取蒲公英基因組總DNA,通過紫外吸收、電泳檢測(cè)和PCR擴(kuò)增檢測(cè)所得DNA的純度和濃度。(2)以提取出的基因組總DNA為模板,對(duì)蒲公英RAPD-PCR反應(yīng)體系中各個(gè)主要的影響因子進(jìn)行優(yōu)化和篩選。(3)利用RAPD分

2、子標(biāo)記技術(shù)和方法對(duì)不同居群蒲公英進(jìn)行檢測(cè),通過計(jì)算遺傳相似系數(shù)并建立其聚類分析圖。(4)提取不同產(chǎn)地的蒲公英基因組總DNA,以核糖體基因組ITS通用引物為引物進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后,用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序。
　　結(jié)果：(1)不同提取方法所得到得DNA純度和濃度存在顯著差異,以改良的CTAB法提取效果最好,純度最高,電泳結(jié)果顯示主條帶最清晰,降解較少。兩種研磨方法所得結(jié)果相近。(2)建立了多態(tài)性高、重復(fù)性好,可用于蒲公英

3、RAPD分析的最佳反應(yīng)體系。25μl反應(yīng)體系中含有:1×TaqMixbuffer、50ngDNA模板、0.4μmol/L引物、1.5mmol/LMg2+、0.25mmol/LdNTPs、1.25UTaq酶。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,38℃復(fù)性1min,72℃延伸2min,共40個(gè)循環(huán);72℃延伸10min,反應(yīng)結(jié)束后,4℃保存。(3)從150條隨機(jī)引物篩選出10條有效引物,在河南4個(gè)品種24個(gè)野生蒲公英居群R

4、APD共擴(kuò)增出1110個(gè)位點(diǎn),平均每個(gè)引物擴(kuò)增出111個(gè)位點(diǎn),每個(gè)居群擴(kuò)增出46.25個(gè)位點(diǎn);在所獲得的95條可重現(xiàn)譜帶中,7條單態(tài),88條多態(tài),多態(tài)性程度達(dá)92.63％,遺傳距離在0.0087-0.7922。(4)蒲公英屬植物ITS序列總長(zhǎng)度約為641-642bp,其中ITS1長(zhǎng)度為255-256bp,5.8S長(zhǎng)度為162bp,ITS2長(zhǎng)度為224bp。序列間共有23個(gè)變異位點(diǎn)。運(yùn)用DNAStar軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析得到蒲公英屬內(nèi)4種植物

5、的系統(tǒng)進(jìn)化樹,這一分析結(jié)果與來自形態(tài)學(xué)的研究結(jié)果基本吻合。
　　結(jié)論：(1)改良的CTAB法適合于蒲公英基因組總DNA的提取。(2)優(yōu)化出的PCR反應(yīng)體系為今后利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行蒲公英鑒定及種質(zhì)資源遺傳多樣性分析奠定了基礎(chǔ)。(3)蒲公英不同種、同一種不同居群間存在明顯的遺傳分化,其中種間差異大于種內(nèi),遺傳多樣性主要存在于居群間;RAPD技術(shù)可以作為蒲公英居群遺傳多態(tài)性、親緣關(guān)系及品種鑒別研究的有效手段。(4)rDNAIT