抗耐藥性金黃色葡萄球菌嵌合藥靶的設(shè)計(jì)、表達(dá)及體內(nèi)活性分析.pdf

1、耐藥性金葡菌(methicillin-resistantStapHylococcusaureus，MRSA)是全球院內(nèi)感染的首要病原菌。在中國(guó)＞80％的金葡菌臨床分離株是MRSA，在西方國(guó)家＞60％。金葡菌細(xì)胞壁肽聚糖合成是由青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin-bindingproteins，PBPs)酶系完成的，PBPs有轉(zhuǎn)糖基酶(transglycosylasedomain，TGase)和轉(zhuǎn)肽酶(transpeptidasedom

2、ain，TPase)兩種酶學(xué)活性，催化細(xì)菌肽聚糖粘肽的交聯(lián)，以維持細(xì)菌固有形態(tài)。因肽聚糖為細(xì)菌必須，而在哺乳動(dòng)物的組織和細(xì)胞中又不存在，因而細(xì)菌肽聚糖及其合成酶系都是藥靶的極佳候選者。β-內(nèi)酰胺類抗生素能抑制其轉(zhuǎn)肽酶活性，進(jìn)而殺滅敏感菌。但MRSA則能編碼一種PBP2a(penicillinbindingprotein2a，PBP2a)分子，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有較低的親和力，幫助細(xì)菌躲避抗生素的攻擊。近年來(lái)的研究表明，PBP2a在M

3、RSA肽聚糖合成中只提供轉(zhuǎn)肽酶活性，而轉(zhuǎn)糖基酶活性須由PBP2提供，即MRSA的耐藥性是由PBP2和PBP2a共同表達(dá)的，均可作為藥靶。如果在分子水平將PBP2和PBP2a的功能域融合，構(gòu)建并表達(dá)-嵌合藥靶，則可利用該藥靶進(jìn)行TGase或/和TPase活性抑制物的篩選，獲得的抑制物可望研發(fā)成抗MRSA感染的新藥，同時(shí)其作用機(jī)制也得到闡明，即是通過(guò)阻斷肽聚糖合成而抑制MRSA的生長(zhǎng)，這對(duì)預(yù)防和控制目前日益嚴(yán)重的耐藥性MRSA菌感染具有重要

4、意義。 本研究在對(duì)MRSAPBP2和PBP2a功能域進(jìn)行充分分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)分子設(shè)計(jì)，將PBP2N-端參與細(xì)菌肽聚糖骨架構(gòu)建的糖基轉(zhuǎn)移酶區(qū)(TGase)，與PBP2aC-端參與肽絞鏈橋形成的轉(zhuǎn)肽酶區(qū)(TPase)編碼基因分別克隆，再經(jīng)分子生物學(xué)操作構(gòu)建成TG-TPase嵌合藥靶，亞克隆于原核和真核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)嵌合藥靶的原核、真核表達(dá)及嵌合藥靶的初步純化，并在金葡菌體內(nèi)證實(shí)表達(dá)了的TG-TPase嵌合藥靶具有耐藥活性，為進(jìn)一步

5、利用其酶學(xué)活性進(jìn)行抗耐藥性金葡菌抑制劑的篩選奠定基礎(chǔ)。 其研究?jī)?nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面： 1.抗耐藥性金葡菌嵌合藥靶的設(shè)計(jì)：①金葡菌PBP2分子的序列多重比對(duì)分析；②耐藥性金葡菌PBP2轉(zhuǎn)糖基酶活性區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其活性發(fā)揮；③耐藥性金葡菌PBP2a轉(zhuǎn)肽酶活性區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其耐藥機(jī)制；④抗耐藥性金葡菌嵌合藥靶的設(shè)計(jì)。 2.MRSA耐藥相關(guān)TG-TPase嵌合藥靶在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)：①利用PCR分別從MRS

6、A基因組上擴(kuò)增出PBP2aTPase、PBP2TGase基因，克隆入pMD18-T載體中構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD-TG和pMD-TP；②通過(guò)酶切連接pMD-TG/XhoⅠ-NotⅠ和pMD-TP/XhoⅠ-NotⅠ片段構(gòu)建了帶有TG-TPase嵌合藥靶的重組質(zhì)粒pMD-TG-TP，并亞克隆入表達(dá)載體pET22b+、pET30b+，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)plysS；③對(duì)pET22b-TG-TP/Rosetta工程菌進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)

7、表達(dá)條件進(jìn)行摸索，獲得的工程菌表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)超聲裂解后，90％以上的融合蛋白質(zhì)以包涵體的形式存在；④將pET22b-TG-TP/Rosetta工程菌表達(dá)得到融合蛋白包涵體經(jīng)Ni-NTA親和純化后，獲得純度達(dá)90％以上的目標(biāo)蛋白，并對(duì)蛋白進(jìn)行質(zhì)譜和Westernblotting鑒定；⑤將純化好的融合蛋白質(zhì)經(jīng)透析法復(fù)性，并采用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后，凍存?zhèn)溆?；⑥為獲得融合蛋白抗體，將融合蛋白免疫Balb/c小鼠，得到相應(yīng)抗體后加等體

8、積甘油凍存?zhèn)溆谩?3.MRSA耐藥相關(guān)TG-TPase嵌合藥靶重組畢赤酵母的構(gòu)建與表達(dá)：①將TG-TPase嵌合藥靶插入真核表達(dá)載體pPIC9K，構(gòu)建了pPIC9K-TG-TP重組質(zhì)粒；②將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化整合入GS115畢赤酵母中，用濃度逐漸增加的G418來(lái)篩選多拷貝菌株，并鑒定其表型；③對(duì)篩選出的菌株在DNA、mRNA及蛋白水平進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，通過(guò)提取轉(zhuǎn)化子的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可得到約1

9、923bp大小的片段，經(jīng)過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)，RT-PCR可擴(kuò)增出約1923bp大小的片段，均與預(yù)期結(jié)果一致。 4.MRSA耐藥相關(guān)TG-TPase嵌合藥靶在金黃色葡萄球菌中的表達(dá)及體內(nèi)活性鑒定：①利用PCR分別從MRSA基因組上擴(kuò)增出PBP2aTP'ase、PBP2TG'ase基因，克隆入pMD18-T在載體中構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD-TG'和pMD-TP'；②通過(guò)酶切連接pMD-TG'/XhoⅠ-NotⅠ和pMD-TP'/Xho

10、Ⅰ-NotⅠ片段構(gòu)建了帶有TG-TP'ase嵌合藥靶的重組質(zhì)粒pMD-TG-TP'，③重組質(zhì)粒pMD-TG-TP'亞克隆入金葡菌表達(dá)載體pYT3，構(gòu)建了pYT3-TG-TP'重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，待重組質(zhì)粒鑒定正確后再電轉(zhuǎn)入金葡菌N315；④重組質(zhì)粒在N315菌中進(jìn)行修飾后再轉(zhuǎn)入MSSA中；⑤應(yīng)用96孔板稀釋法測(cè)定了6種抗生素(苯唑西林、注射用亞胺培南、頭孢氨芐、加替沙星、萘夫西林、鹽酸萬(wàn)古霉素)對(duì)pYT3-TG-TP'/MS

11、SA的MIC和MBC，并對(duì)重組菌的體外生長(zhǎng)抑制曲線進(jìn)行了測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果顯示重組工程菌MIC和MBC有不同程度的改變，其中對(duì)苯唑西林、頭孢氨芐、加替沙星、萘夫西林的MIC和MBC值改變較為明顯；重組菌體外生長(zhǎng)抑制曲線測(cè)定，顯示苯唑西林、頭孢氨芐、加替沙星、萘夫西林4種抗生素在不同濃度時(shí)對(duì)pYT3-TG-TP'/MSSA、pYT3/MSSA和MSSA菌密度之間的關(guān)系和體外殺菌效果，有效殺菌結(jié)果與其MIC值相同，證明了所構(gòu)建的重組工程菌pYT

12、3-TG-TP'/MSSA具有了多重耐藥活性。 綜上所述，本研究設(shè)計(jì)了抗耐藥性金葡菌嵌合藥靶，并進(jìn)行了TG-TPase嵌合藥靶的原核和真核表達(dá)，并在原核表達(dá)后，經(jīng)包涵體提取、變性、復(fù)性等實(shí)驗(yàn)，純化得到了嵌合藥靶蛋白，為體外酶學(xué)活性實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。本研究還將TG-TPase嵌合藥靶在藥物敏感金黃色葡萄球菌(methicillinsensitiveStaphylococcusaureus，MSSA)中進(jìn)行了表達(dá)及活性研究，在細(xì)菌體內(nèi)