缺血或感染因素對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體的毒性作用及姜黃素對(duì)毒性作用的體內(nèi)外阻斷研究.pdf

1、腦室周?chē)踪|(zhì)軟化(periventricular leukomalacia,PVL)是目前早產(chǎn)兒腦損傷的最主要類(lèi)型,為早產(chǎn)兒死亡和其后發(fā)生腦癱和認(rèn)知行為障礙的主要因?yàn)?。腦室周?chē)踪|(zhì)主要由髓鞘構(gòu)成細(xì)胞-少突膠質(zhì)細(xì)胞(Oligodendrocyte,OL)所構(gòu)成。OL由前體細(xì)胞發(fā)育而來(lái),歷經(jīng)OL前體、不成熟OL以及成熟OL幾個(gè)階段。研究表明,在胎齡23～32周,OL前體大量出現(xiàn)于腦室周?chē)踪|(zhì)內(nèi),對(duì)自由基攻擊具有明顯易損性,因而OL前體被公認(rèn)

2、為是PVL病變的主要靶細(xì)胞,在早產(chǎn)兒PVL的發(fā)病機(jī)理中起著關(guān)鍵作用。缺血學(xué)說(shuō)和感染學(xué)說(shuō)是目前詮釋早產(chǎn)兒PVL發(fā)病機(jī)理相并列的兩大學(xué)說(shuō),缺氧缺血可導(dǎo)致反應(yīng)性氧自由基(ROS)生成顯著增加,在OL前體對(duì)自由基攻擊內(nèi)在易損性基礎(chǔ)上,ROS通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白氧化和DNA損傷等途徑,導(dǎo)致OL前體死亡。感染/炎癥誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,是感染型PVL發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)大量活性氧和活性氮的生成,尤其由NO和O2-·反應(yīng)后所生成的

3、過(guò)氧亞硝酸鹽(Peroxynitrite,ONOO-),被認(rèn)為是導(dǎo)致OL前體死亡的主要毒性因子。不論是缺血性因素抑或是感染性因素,其最終的病理改變均為腦室周?chē)踪|(zhì)OL前體的受損和丟失,而缺血或感染/炎癥時(shí)產(chǎn)生的大量自由基所介導(dǎo)的OL前體損傷,則可能是PVL發(fā)生發(fā)展的最終共同通路。迄今對(duì)PVL防治尚無(wú)有效方法。姜黃素是一種從中藥姜黃中提取的酚類(lèi)物質(zhì),具有很強(qiáng)的抗氧化和抗炎癥反應(yīng)作用,可減少自由基的生成和促進(jìn)自由基的清除,還能減少各種炎癥介

4、質(zhì)的合成和分泌,減少組織細(xì)胞氧化性和炎癥性損傷。研究表明,姜黃素對(duì)缺氧缺血或內(nèi)毒素引起的肝、心、腎、腦等損害有一定的保護(hù)作用,但有關(guān)其在PVL中的作用及機(jī)制研究尚無(wú)報(bào)導(dǎo)。
　　 在國(guó)家自然科學(xué)基金和上海市教委基金的資助下,本課題首先對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞抗氧化損傷能力的成熟依賴(lài)性進(jìn)行研究,在此基礎(chǔ)上,從缺血因素和感染因素的角度,分別從細(xì)胞和在體兩個(gè)層面,探討缺血因素和感染因素對(duì)OL前體的毒性作用,以及姜黃素對(duì)毒性作用的體內(nèi)外阻斷效果,藉

5、以闡明姜黃素對(duì)OL前體的可能保護(hù)作用及其內(nèi)在機(jī)制,為今后對(duì)早產(chǎn)兒PVL成功防治探索可行性途經(jīng)。
　　 第一部分少突膠質(zhì)細(xì)胞抗氧化損傷能力的成熟依賴(lài)性研究
　　 取SD新生大鼠腦組織分別進(jìn)行體外OL前體和成熟OL培養(yǎng),探討OL抗氧化損傷能力的成熟依賴(lài)性。顯示在相同H2O2濃度刺激下,OL前體的細(xì)胞活力明顯低于成熟OL。OL前體的抗氧化物質(zhì)T-SOD、GSH-Px和CAT活力及GSH含量均明顯低于成熟OL,氧化物質(zhì)MDA含量

6、則顯著高于成熟OL。OL前體的促凋亡基因產(chǎn)物Bax和Caspase-3的合成量均明顯高于成熟OL,抗凋亡基因產(chǎn)物Bcl-2的含量則顯著低于成熟OL,OL前體的Bcl-2/Bax比例亦明顯低于成熟OL。上述結(jié)果提示,OL對(duì)自由基攻擊存在成熟依賴(lài)性,OL前體的抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)育不完善以及Bcl-2/Bax比例的差異,是導(dǎo)致OL前體對(duì)自由基的處理能力低下、對(duì)自由基攻擊易損的重要因?yàn)椤?br>　　 第二部份缺血因素對(duì)OL前體的毒性作用及姜黃素對(duì)

7、毒性作用的體外阻斷研究
　　 以H2O2損傷OL前體作為氧化應(yīng)激損傷模型,探討對(duì)OL前體的毒性作用及姜黃素對(duì)毒性作用的體外阻斷研究。顯示對(duì)培養(yǎng)OL前體應(yīng)用100μmol/L H2O2刺激,OL前體的活力降至正常對(duì)照組的52.7％；凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增高；氧化物質(zhì)MDA含量顯著上升,抗氧化物質(zhì)SOD、GPx和CAT的活性顯著降低,GSH含量明顯減少；促凋亡蛋白Bax以及活化型caspase-3、9的顯著增加以及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)

8、顯著降低。應(yīng)用10μg/ml姜黃素則可明顯提高OL前體的細(xì)胞活力至98.1％；明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；顯著增加SOD、GPx和CAT的活性,提升GSH含量以及降低MDA濃度；并明顯上調(diào)Bcl-2的表達(dá)以及抑制H2O2誘導(dǎo)的Bax表達(dá)及caspase-3、9的活化增加,提高Bcl-2/Bax的比例。上述結(jié)果提示,姜黃素對(duì)OL前體氧化損傷的保護(hù)作用,與減輕OL前體的脂質(zhì)過(guò)氧化、提高Bcl-2/Bax的比例以及抑制caspases的活

9、化,從而增強(qiáng)OL前體的抗氧化能力、抑制由H2O2誘導(dǎo)的OL前體凋亡。
　　 第三部份缺血因素對(duì)OL前體的毒性作用及姜黃素對(duì)毒性作用的體內(nèi)阻斷研究
　　 對(duì)2日齡缺血型PVL新生大鼠在PVL前和PVL后即刻應(yīng)用姜黃素50mg/kg.d,從體內(nèi)評(píng)估姜黃素的腦保護(hù)效果。腦病理顯示兩個(gè)用藥組的腦白質(zhì)病變較PVL組明顯改善,其中重度白質(zhì)病變的發(fā)生率分別較PVL組降低了62.5％和43.8％,另有12.5％的腦白質(zhì)完全正常；免疫組化

10、顯示用藥組腦內(nèi)的O4和MBP染色的IOD值均較PVL組非常顯著地增高；并非常明顯地抑制由缺氧缺血引起的SOD、GPx和CAT活性的下降、GSH含量的減少,以及MDA含量的升高:用藥組的Bcl-2合成量亦較PVL組明顯增加,Bax以及caspases-3、9活化片段的合成量均較PVL組明顯減少。上述結(jié)果提示,姜黃素對(duì)缺氧缺血的腦白質(zhì)保護(hù)作用,與其調(diào)節(jié)腦內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)、以及調(diào)節(jié)腦內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān),從而可顯著減輕缺氧缺血引起的OL的

11、丟失,對(duì)PVL新生大鼠腦白質(zhì)損傷起保護(hù)作用。
　　 第四部份感染因素對(duì)OL前體的毒性作用及姜黃素對(duì)毒性作用的體外阻斷研究
　　 建立小膠質(zhì)細(xì)胞與OL前體共培養(yǎng)模型,探討LPS對(duì)OL前體的毒性作用及姜黃素對(duì)毒性作用的體外阻斷研究。結(jié)果顯示LPS對(duì)單純培養(yǎng)的OL前體并無(wú)直接毒性,在小膠質(zhì)細(xì)胞與OL前體共存時(shí),LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活,從而介導(dǎo)OL前體凋亡。姜黃素能抑制LPS誘導(dǎo)的OL前體細(xì)胞凋亡。LPS刺激使小膠質(zhì)細(xì)胞NO、

12、O2-·的生成量均顯著增加,iNOS的基因表達(dá)及其產(chǎn)物iNOS的含量均較對(duì)照組非常顯著升高,NAO亞基胞膜gp91-phox和p67-phox的表達(dá)亦較對(duì)照組非常明顯增加。應(yīng)用10μg/ml姜黃素,小膠質(zhì)細(xì)胞的NO、O2-·的生成量均明顯減少,iNOS基因的mRNA和蛋白表達(dá)均較LPS組非常顯著降低,NAO亞基胞膜gp91-phox和p67-phox的合成亦較LPS組顯著減少。上述結(jié)果提示,姜黃素對(duì)OL前體的保護(hù)作用,主要通過(guò)抑制LPS

13、誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)iNOS的表達(dá)和NAO活化,從而減少其產(chǎn)物NO和O2-·的產(chǎn)生,起到保護(hù)OL前體的作用。
　　 第五部份感染因素對(duì)OL前體的毒性作用及姜黃素對(duì)毒性作用的體內(nèi)阻斷研究
　　 對(duì)2日齡感染型PVL新生大鼠在PVL前和PVL后即刻應(yīng)用姜黃素50mg/kg.d,從體內(nèi)評(píng)估姜黃素的腦保護(hù)效果。腦病理顯示兩個(gè)用藥組的腦白質(zhì)病變較PVL組明顯改善,其中重度白質(zhì)病變的發(fā)生率分別較PVL組降低了25％和18.7％,另有31

14、.3％和34.4％的腦白質(zhì)完全正常；免疫組化顯示用藥組腦內(nèi)的O4和MBP染色的IOD值均較PVL組顯著增高；IB4免疫熒光標(biāo)記顯示腦內(nèi)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)明顯少于PVL組；腦內(nèi)NO含量和O2-·的生成能力均明顯降低；腦內(nèi)iNOS的基因表達(dá)及其產(chǎn)物iNOS的合成量均較PVL組非常顯著減低；腦內(nèi)NAO亞基胞膜gp91-phox和p67-phox的合成亦較PVL組非常顯著減少。上述結(jié)果與體外研究結(jié)果一致,提示姜黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的感染型PVL的腦

15、白質(zhì)保護(hù)作用,主要與抑制了腦內(nèi)iNOS和NAO的活化,從而減少NO和O2-·的大量生成有關(guān)。
　　 通過(guò)上述缺血或感染因素對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體的毒性作用、以及姜黃素對(duì)毒性作用的體內(nèi)體外阻斷系列研究,初步闡明了缺氧缺血氧化應(yīng)激以及LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活導(dǎo)致OL前體死亡的相關(guān)機(jī)理,初步探討了姜黃素對(duì)OL前體的可能保護(hù)作用及其內(nèi)在機(jī)制,尤其證實(shí)姜黃素在阻斷缺氧缺血、感染/炎癥導(dǎo)致OL前體死亡的相當(dāng)有效性,可望為今后對(duì)早產(chǎn)兒PVL的成功