同種排斥過程中TLR5及Foxp3的表達、調(diào)節(jié)及意義.pdf

1、研究目的: 迄今為止的研究表明Treg細胞具有免疫負調(diào)節(jié)作用，TLR5的激活對某些損傷因素具有免疫保護作用，Treg細胞上TLR5/TLR7/8高表達，但是同種移植狀態(tài)下，TLR5的活化狀態(tài)和活化的調(diào)節(jié)及對Treg的影響途徑、機理和信號傳導(dǎo)途徑尚不清楚。我們推測利用Flagellin刺激同種移植TLR5活化，可能在體內(nèi)擴增Treg的比例，增強Foxp3的表達，從而達到形成移植耐受的目的。 本課題首先分析了同種皮膚移植急性

2、排斥過程中TLR5和Foxp3基因的動態(tài)表達狀況，然后應(yīng)用Rapa和CsA兩種不同的免疫抑制劑對小鼠同種皮膚移植模型進行耐受初步誘導(dǎo)，研究了Rapa和CsA體內(nèi)應(yīng)用對TLR5和Foxp3基因表達的影響及與移植物生存的關(guān)系；研究了Flagellin體外處理對移植耐受模型中T細胞及相關(guān)分子TLR5、Foxp3表達影響及與Rapa和CsA是否與協(xié)同作用；探討了同種移植狀態(tài)下TLR5表達的變化及意義，探討TLR5和Foxp3表達的相關(guān)性，旨在闡

3、明Rapa、CsA及Flagellin在同種移植耐受狀態(tài)下，是否能夠通過激活TLR5，增強Treg的活性，強化免疫耐受的誘導(dǎo)，為利用TLR5特異配體-Flagellin和抗排斥藥物Rapa、CsA聯(lián)合進行同種移植耐受誘導(dǎo)奠定實驗基礎(chǔ)，為CD4+CD25+ Treg體外擴增和應(yīng)用于臨床防治同種移植排斥反應(yīng)探索新的途徑。 實驗方法: 1.Flagellin的提取和鑒定：利用LB營養(yǎng)培養(yǎng)基擴增甲型副傷寒桿菌，用PBS離心后洗滌

4、按照文獻[25]方法分離粗制鞭毛蛋白（Flagellin），然后通過Sephacryl S-200凝膠柱分離不同分子量的蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE觀察并收集目的蛋白（Flagellin），透析過夜，然后利用抗Flagellin抗體，通過Western Blot檢測目的蛋白的特異性。純化的Flagellin溶液經(jīng)紫外分光光度儀測光密度OD260、OD280值，按照公式計算蛋白含量，置-20℃儲存。 2.體內(nèi)實驗：以B6小鼠為供體

5、，BABL/c小鼠為受體，建立小鼠同種皮膚移植模型。移植后第1天BABL/c小鼠分別給予Rapa（1.5mg/kg）或CsA（10mg/kg）及生理鹽水腹腔注射進行耐受誘導(dǎo)，每日1次，連續(xù)14日。移植后第1、7、10、14、21天，分別取實驗組及對照組小鼠脾臟及移植部位的皮片，采用異硫基氫酸胍（TRIzol）一步法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，以GAPDH作為對照，檢測TLR5及Foxp3mRN

6、A的相對表達量。 3.體外實驗：分離純化同種移植后第10天的小鼠脾T細胞，加入不同濃度的Flagellin處理3、6、12h后測定TLR5和Foxp3 mRNA的表達量，探討Flagellin作用的最佳濃度及時間；進而在移植后第10天，提取耐受誘導(dǎo)的BABL/c小鼠脾細胞（術(shù)后第14天對照組移植皮片全部排斥）T細胞，經(jīng)不同濃度Flagellin、Rapa、CsA體外處理后，RT-PCR檢測TLR5及Foxp3 mRNA的相對表達

7、量。同時選擇未行移植術(shù)的正常BALB/c小鼠T細胞，經(jīng)不同濃度Flagellin、Rapa、CsA體外處理后，檢測TLR5及Foxp3 mRNA的相對表達量。 實驗結(jié)果: 1.SDS-PAGE顯示在分子量為52kD處有目的蛋白條帶，Western Blot結(jié)果顯示抗鞭毛抗體染色呈陽性。表明鞭毛蛋白提取成功。提取的蛋白濃度為75.03μg/ml。 2.與生理鹽水對照組（12.8±1.6d）相比，同種移植后體內(nèi)應(yīng)用C

8、sA（22.0±1.9d）或Rapa（23.8±2.ld）均可明顯延長移植皮片的存活期（p<0.05）。Rapa處理組與CsA處理組相比，延長移植物存活的能力無明顯差別，但Rapa處理組小鼠生存狀態(tài)比CsA處理組更佳。 3.對照組同種移植后TLR5和Foxp3的表達均在排斥高峰期（移植后第10d）升高最明顯，之后Foxp3的表達迅速下降，而TLR5的表達持續(xù)到移植后14d才開始下降。小鼠皮片急性移植排斥期1、7、10、14、21

9、天，移植受體脾細胞的TLR5與Foxp3變化趨勢明顯正相關(guān)。 4.體內(nèi)給予CsA后，TLR5和Foxp3的表達第7天就明顯升高，第10天達到高峰，F(xiàn)oxp3在第14天恢復(fù)至起始水平，而TLR5在第21天恢復(fù)至起始水平；與對照組相比，在同種皮片移植后1、7、10、14、21天，Rapa體內(nèi)處理組脾細胞TLR5 mRNA表達明顯上調(diào)；TLR5表達量較CsA組和對照組明顯增多，且停藥后，第21天表達量仍明顯高于CsA組和對照組。而Fo

10、xp3的表達的變化與CsA組無顯著變化。 5.體外實驗證明：1）Flagellin、Rapa、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA均可促進正常BABL/c小鼠T細胞的TLR5 mRNA明顯高表達（p<0.05），其中Flagellin+Rapa聯(lián)合處理組增高更明顯，而單獨用CsA處理組與未處理組相比無統(tǒng)計學差異。Flagellin處理組、Rapa組、Flagellin+Rapa聯(lián)合處理組、Flagellin+

11、CsA聯(lián)合處理組的Foxp3 mRNA均明顯高表達（p<0.05），其中Flagellin+Rapa聯(lián)合處理組的變化最明顯。單獨使用CsA處理組與未處理組相比無統(tǒng)計學差異。2）經(jīng)不同濃度Flagellin處理急性排斥期小鼠T細胞不同時間后發(fā)現(xiàn)，TLR5 mRNA在Flagellin濃度100ng/ml，培養(yǎng)6h表達最高。Foxp3mRNA在Flagellin濃度1000ng/ml，培養(yǎng)6h表達最高，且在所研究的各時間點，F(xiàn)lagelli

12、n均能促進Foxp3表達。3）Flagellin、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA均可促進急性排斥期BABL/c小鼠T細胞的TLR5 mRNA表達，其中Flagellin+Rapa聯(lián)合組增高更明顯，而單獨用CsA或Rapa處理組的TLR5 mRNA表達無顯著改變。Flagellin、CsA、Rapa、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA聯(lián)合處理均可促進Foxp3 mRNA表達，其中Flagel

13、lin+Rapa聯(lián)合處理組增高更明顯。 結(jié)論: 1.體內(nèi)應(yīng)用Rapa或CsA均可明顯延長同種移植皮片的存活時間，Rapa在抑制移植物排斥、改善宿主生存狀態(tài)方面效果明顯優(yōu)于CsA。 2.同種移植急性排斥高峰期，TLR5和Foxp3表達升高，Rapa可以明顯增強同種移植排斥期TLR5與Foxp3的表達，尤其是使Foxp3表達持續(xù)升高，CsA也可促進這兩種基因的表達，但持續(xù)時間較短。 3.成功提取甲型副傷寒桿菌

14、的鞭毛蛋白并進行了初步鑒定。 4.Rapa在體外可促進移植耐受模型T細胞的TLR5和Foxp3的基因表達，F(xiàn)lagellin可以協(xié)同增強Rapa這一作用。CsA可促進排斥高峰期T細胞Foxp3表達，但對TLR5表達無明顯影響，與Flagellin無協(xié)同作用。Flagellin體外可以促進排斥高峰期T細胞TLR5和Foxp3的表達，并增強Rapa的作用效果。 5.Rapa和Flagellin體外均可促進正常小鼠脾T細胞的T