復合功能基因投遞系統(tǒng)的構建和體內(nèi)外研究.pdf

1、細菌磁小體（BMPs）是趨磁性細菌體內(nèi)依靠生物礦化法合成的磁性納米顆粒，主要由磁核和包被磁核的脂質(zhì)膜兩部分組成。磁小體本身所具有的獨特性質(zhì)，使其在許多領域得到了廣泛的應用，但作為基因載體的應用研究還很少。本文通過對磁小體的修飾和改性，將其構建成具有磁靶向和跨膜復合功能的基因投遞系統(tǒng)，并在此基礎上使用該基因投遞系統(tǒng)對人腦膠質(zhì)瘤進行體內(nèi)外基因治療實驗，并探討了治療效果。主要研究內(nèi)容如下： ⑴通過FTIR、XPS、TEM和HRTEM對

2、磁小體脂質(zhì)膜的組分、官能團和微觀形貌進行觀察和分析，發(fā)現(xiàn)磁小體具有獨特的微觀排列形貌和粒徑分布，平均粒徑為45nm，飽和磁化強度為74.33emu/g，并采用熒光胺的方法對磁小體脂質(zhì)膜上氨基含量進行了定量分析，發(fā)現(xiàn)每毫克磁小體的脂質(zhì)膜上含有58.58nmol的氨基基團；通過XRD、SQUID和紫外-可見分光光度計對磁小體磁核的組分和磁性能進行分析，發(fā)現(xiàn)磁小體的磁核由四氧化三鐵晶體組成，具有較強的磁響應性和分散穩(wěn)定性，并通過ICP-MS分

3、析了磁小體中鐵元素的含量為每毫克磁小體含有0.605mg的鐵元素，含有約3.3549×1012個磁小體顆粒；細胞毒性實驗的結果證實了磁小體具有很好的生物相容性。 ⑵通過碳二亞胺（EDC·HCI）偶合法，制備出.具有磁靶向的基因投遞系統(tǒng)（BMPs-PAMAM），并優(yōu)化了制備條件，在此基礎上將跨膜多肽（Tat）借助偶聯(lián)劑（Sulfo-LC-SPDP）連接到BMPs-PAMAM磁性粒子表面，制備出具有磁靶向和跨膜復合功能的基因投遞系統(tǒng)

4、（Tat-BMPs-PAMAM）。通過FTIR、XPS、Zeta Potential Analyzer、TEM、SQUID和紫外，可見分光光度計對復合功能基因投遞系統(tǒng)的結構、組成、微觀形貌和磁性能進行了分析表征。定量了每毫克BMPs表面接枝有0.056mg的PAMAM大分子和0.027mg的Tat多肽，大約每個BMPs上接枝了1472個PAMAM大分子和3190個Tat多肽分子。該投遞系統(tǒng)粒徑均勻，約為50nm；具有較強的磁響應性和分散

5、穩(wěn)定性，其飽和磁化強度為62.46emu/g。 ⑶凝膠電泳阻滯實驗證明了兩種基因投遞系統(tǒng)（BMPs-PAMAM和Tat-BMPs-PAMAM）均能夠與報告質(zhì)粒（pEGFP與pGL-3）形成非常穩(wěn)定的復合物，并且對報告質(zhì)粒具有很好的酶切保護作用；細胞毒性實驗證實了兩種投遞系統(tǒng)具有較好的生物相容性。使用兩種基因投遞系統(tǒng)將兩種報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細胞，結果顯示，當BMPs-PAMAM與報告質(zhì)粒的質(zhì)量比為20：1、Tat-BMPs-PA

6、MAM與報告質(zhì)粒的質(zhì)量比為12.5：1時，均具有最高的轉(zhuǎn)染效率，分別為16.65％和20.56％，并且外加磁場的靶向性作用能夠使兩種基因投遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率提高25％。體外磁靶向跨膜定位實驗證明所制備的兩種復合功能基因投遞系統(tǒng)（BMPs-PAMAM和Tat-BMPs-PAMAM）具有較好的磁靶向和跨膜復合功能，其轉(zhuǎn)染效率分別為為11.56％，13.28％，高于商用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染效率9.86％。 ⑷

7、對兩種基因投遞系統(tǒng)進行放射性元素99mTc標記，用SPECT考察了兩種投遞系統(tǒng)荷載pGL-3質(zhì)粒的復合物在正常SD大鼠體內(nèi)分布情況，并詳細考察了注射方式、Tat多肽和外加磁場對復合物在各臟器中分布和跨血腦屏障能力的影響，顯示其磁靶向和跨膜的復合功能。使用U251膠質(zhì)瘤細胞模型研究了兩種基因投遞系統(tǒng)的體外基因轉(zhuǎn)染對腫瘤的抑制效果，并與Lipofectamine2000進行了對比。通過細胞免疫熒光、細胞免疫組化和Western blot檢測

8、相關靶蛋白的表達，證明了Tat-BMPs-PAMAM與Lipofectamine2000對靶蛋白具有相似的治療效果。體外細胞生物學特性實驗證明，經(jīng)兩種基因投遞系統(tǒng)基因治療后的U251細胞的增殖活性和侵襲能力均顯著降低，凋亡細胞數(shù)顯著上升，并且Tat-BMPs-PAMAM/psiRNA比BMPs-PAMAM/psiRNA具有更好的體外抑制效果，與Lipofectamine2000/psiRNA組相比沒有顯著性的差異。 ⑸以荷U25