肌腱病模型構(gòu)建和治療的體外及體內(nèi)研究.pdf

1、目的：肌腱病是臨床常見病和多發(fā)病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍未完全闡明。相應(yīng)之，肌腱病現(xiàn)在仍是經(jīng)驗(yàn)性對癥治療，缺乏明確的治療方案。其中一個(gè)重要的原因是缺乏良好的肌腱病動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)探討一種動(dòng)物模型建立的方法，并基于此模型的基礎(chǔ)上，模擬目前臨床上肌腱病的治療方法，評估治療機(jī)制和治療效果，為臨床治療肌腱病提供理論依據(jù)。
　　方法：培養(yǎng)分離肌腱干細(xì)胞（TSCs），用Kartogenin(KGN)作用于體外培養(yǎng)的TSCs，觀察其對 TSCs

2、性狀的影響，包括細(xì)胞增殖，分化，mRNA表達(dá)。體內(nèi)將KGN注射或植入多個(gè)部位的肌腱，觀察KGN誘導(dǎo)肌腱病形成，篩選出可重復(fù)性好的建模方法。肌腱病模型構(gòu)建成功后，模擬臨床治療的方法，將富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）在肌腱病早期和晚期經(jīng)皮注射入受損肌腱，觀察PRP治療肌腱病的效果，并在體外將PRP和 KGN干預(yù)細(xì)胞培養(yǎng)，在細(xì)胞層面研究 PRP對肌腱病的作用機(jī)制。最后將臨床上用以治療肌腱病的Toradol(K

3、etorolac tromethamine，KT)在體外和體內(nèi)作用于肌腱細(xì)胞和肌腱組織，觀察和研究Toradol治療肌腱病的機(jī)制和效果。
　　結(jié)果：成功分離培養(yǎng)TSCs后，將不同濃度的KGN作用于細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)KGN顯著促進(jìn)了 TSCs向軟骨細(xì)胞分化，相應(yīng)軟骨標(biāo)志分子基因表達(dá)顯著升高。KGN與藻酸鹽復(fù)合為膠珠(bead)植入大鼠跟腱可以模擬肌腱病的發(fā)病過程和病理特征，包括細(xì)胞增多，肌腱纖維結(jié)構(gòu)紊亂，新生血管增多，粘多糖(glyco

4、saminoglycan，GAG)聚積，出現(xiàn)軟骨樣細(xì)胞，鈣化組織形成。在此模型基礎(chǔ)上，將 PRP經(jīng)皮注射入肌腱病區(qū)域，發(fā)現(xiàn)肌腱病早期注射 PRP可以顯著抑制肌腱病的發(fā)展，促進(jìn)受損肌腱的修復(fù)；晚期軟骨樣組織形成后，PRP注射治療沒有明顯改善肌腱修復(fù)。進(jìn)一步，我們將肌腱病晚期形成的軟骨樣組織手術(shù)切除后，將 PRP植入肌腱缺損處，發(fā)現(xiàn) PRP促進(jìn)了肌腱修復(fù)。結(jié)果提示在肌腱病晚期，建議將非腱性組織切除后植入PRP。最后，體外和體內(nèi)研究Torad

5、ol治療肌腱病的結(jié)果表明，Toradol抑制肌腱細(xì)胞增殖，高濃度下對肌腱細(xì)胞有明顯毒性作用，注射入肌腱組織會破壞肌纖維結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)TSCs向脂肪系細(xì)胞分化。
　　結(jié)論：KGN在體外能促進(jìn) TSCs向軟骨細(xì)胞分化，體內(nèi)可誘導(dǎo)肌腱病發(fā)生；PRP經(jīng)皮注射在早期可預(yù)防肌腱病發(fā)生和促進(jìn)受損肌腱的修復(fù)，晚期無明顯治療作用；肌腱病晚期，手術(shù)切除肌腱組織內(nèi)軟骨樣或骨樣組織后植入 PRP，可以促進(jìn)肌腱修復(fù)；臨床上常用的Toradol對肌腱細(xì)胞和肌腱組

6、織有破壞作用。
　　第二部分：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的神經(jīng)干細(xì)胞促進(jìn)大腦中動(dòng)脈栓塞后神經(jīng)功能恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：腦卒中是由于腦部供血受阻而迅速發(fā)展成的腦功能損傷。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是細(xì)胞移植治療腦卒中的良好的細(xì)胞來源。本實(shí)驗(yàn)將iPSCs來源的NSCs移植修復(fù)大腦中動(dòng)脈栓塞后神經(jīng)功能

7、受損的大鼠模型，探討其對受損腦組織的修復(fù)和神經(jīng)功能的恢復(fù)機(jī)制和作用。
　　方法：體外用RA和無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)iPSCs和ESCs向NSCs分化。誘導(dǎo)成功后，全麻下從大鼠頸外動(dòng)脈切口將4-0尼龍線插入180mm-200mm至頸內(nèi)動(dòng)脈，直到栓塞大腦中動(dòng)脈，建立MCAO模型。將CM-DiI標(biāo)記的NSCs注射入紋狀體，與假手術(shù)組和 PBS注射相比較，觀察細(xì)胞在體內(nèi)的存活，遷移和分化。并評估 NSCs注射后對大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)作用。

8、　　結(jié)果：iPS-S-01和HuES1表達(dá)高水平的Oct4，Sox2和Nanog。iPSC來源NSC和ESC來源的NSC均表達(dá)Nestin,β-tubulin and GFAP。細(xì)胞移植7天后，紋狀體周圍可見CM-DiI標(biāo)記細(xì)胞(68.2±2.3 count/field)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，移植7天的標(biāo)記細(xì)胞表達(dá)Nestin(68.5±2.8%)，和β-tubullin(25.7±12.3%)。移植后3周，細(xì)胞移植組的神經(jīng)功能恢