毛囊重建體內(nèi)模型構(gòu)建的實驗研究.pdf

1、背景：毛囊的形態(tài)發(fā)生是上皮與真皮細胞間相互作用的結(jié)果。上皮中的多能干細胞和真皮中的毛乳頭細胞是毛囊形態(tài)發(fā)生中不可或缺的成分，但這兩者間通過何種機制發(fā)生作用，有哪些信號、因子參與目前尚不完全清楚。體外構(gòu)建功能完整的毛囊比較困難，因為它需要比較復(fù)雜的三維空間結(jié)構(gòu)。毛囊重建的體外模型已從單層毛囊細胞的培養(yǎng)演變到用毛囊細胞三維構(gòu)建含有毛囊的人造皮膚。雖然，這對毛囊組織工程研究具有一定價值，但是，體外毛囊模型的構(gòu)建在回答一些有關(guān)毛囊發(fā)育信號通道和

2、毛發(fā)周期調(diào)控復(fù)雜的問題上存在一定的缺陷。在體內(nèi)，毛囊除通過血管供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣外，也通過旁分泌機制接受來自鄰近細胞的信號分子，如生長因子、細胞因子的調(diào)節(jié)[3-4]。而體外毛囊的重建由于營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣、信號分子的缺失或者減少并不能完全模型體內(nèi)毛囊發(fā)育過程。因此，建立適宜的體內(nèi)毛囊發(fā)育模型用以研究毛囊形態(tài)發(fā)生及周期循環(huán)分子機制非常重要。毛囊細胞移植是治療禿發(fā)的一種實驗性細胞療法，以獲取增殖能力強并且具有毛囊誘導(dǎo)能力的毛乳頭細胞為前提。但是

3、，毛乳頭細胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴增后其誘導(dǎo)能力會逐漸喪失。目前，與毛乳頭細胞誘導(dǎo)能力相關(guān)的明確的細胞表面標志尚未得到識別，也沒有簡便的體外實驗用以檢測毛乳頭細胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力。因此，建立一個簡便、可靠，并能夠直接檢測毛乳頭細胞誘導(dǎo)能力的動物模型也很有必要。目前，有多種毛囊重建體內(nèi)模型。小室法，最早由Lichti和Weinberg介紹使用，Lichiti在2008年又對此模型進行了改進，是已確定的可用于毛囊重建研究的模型之一。另外一種模型是注射法

4、，最先由Morris介紹使用，后來Zheng對此模型進行了改善。注射法是將上皮和真皮細胞的混合物注射至真皮內(nèi)重建毛囊。三明治法最先由Reynolds和Jahoda介紹使用，是將毛乳頭細胞插在供體大鼠足墊皮膚的上皮與真皮之間，然后將復(fù)合物移植至受體鼠皮膚創(chuàng)區(qū)。皮瓣法是近來發(fā)展的，是在裸鼠背部置于一塊硅膠板，將上皮薄片平鋪在硅膠板上，然后將真皮細胞移植至上皮薄片上，最后將裸鼠背部皮瓣覆蓋縫合。每種毛囊重建體內(nèi)模型均有其適用情況，小室法具有較

5、好的重復(fù)性，被廣泛應(yīng)用。上皮與真皮細胞被移植到小室后兩者能夠密切接觸，為毛囊的重建提供了適宜的空間和環(huán)境，并排除了受體自身細胞的干預(yù)。移植后3周移植部位有新的毛發(fā)長出，毛發(fā)質(zhì)量、密度與正常毛發(fā)相似，這為毛囊重建的評估提供了最直接的證據(jù)。實驗中，我們構(gòu)建了小室法毛囊發(fā)育模型，并探討了上皮與真皮細胞何者在毛囊重建中起主導(dǎo)作用。但是，小室法仍存在一些缺陷，如對動物創(chuàng)傷太大;皮膚創(chuàng)面容易感染隨后動物死亡;需要大量的細胞（大約需1×107上皮細胞

6、+1×107真皮細胞）;一只動物只能做一個小室移植。這將一定程度上影響毛囊重建的成功率。另外，一些很難獲取的或者經(jīng)過特殊處理的細胞用小室法移植，實驗難度與實驗耗費會明顯增加。因此，我們嘗試使用微型小室進行細胞移植，以期改善上述不足。毛乳頭細胞是毛囊重建中不可或缺的真皮成分。目前，國內(nèi)外學(xué)者主要通過顯微解剖法和酶消化法分離獲取鼠觸須毛囊和人頭皮毛囊中的毛乳頭細胞，其工作難度大，獲取率低。在毛囊重建的研究中，迫切需要一種簡便的方法來獲取大量

7、的具有誘導(dǎo)能力的毛乳頭細胞。出生后1d內(nèi)的C57小鼠背部皮膚中毛囊大部分處于形態(tài)發(fā)生第4階段之前，真皮中含有的大量的具有誘導(dǎo)能力的毛乳頭細胞。將新生鼠真皮細胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴增這為毛乳頭細胞的來源提供了一種理論可行的途徑。我們用培養(yǎng)的真皮細胞與新鮮的上皮細胞一起移植，以探討培養(yǎng)的真皮細胞用于毛囊重建的可行性。
　　 目的：①構(gòu)建小室法毛囊重建模型；②構(gòu)建微型小室法毛囊重建模型；③探討培養(yǎng)的新生鼠真皮細胞用于毛囊重建的可行性。

8、　　 方法：⑴取新出生1d內(nèi)的C57BL/6近交系小鼠背部皮膚，用0.1％中性蛋白酶4℃消化過夜。PBS（含1％青、鏈霉素）漂洗后，用顯微鑷將表皮和真皮分離并分別剪碎，分別用0.2％Ⅰ型膠原酶37℃消化1h左右，間斷吹打，直到所有組織被消化。加入DMEM高糖培養(yǎng)基（含10％FBS）終止消化。用200目篩網(wǎng)過濾以去除組織碎塊和細胞團塊，將收集的單細胞混懸液于離心管中以1000r/min離心5min，重復(fù)離心2次，吸去上清液，加入DMEM

9、高糖培養(yǎng)基，分別調(diào)整細胞濃度為1×107個/ml。取真皮細胞（1×107個）+表皮細胞（1×107個）用200μl高糖培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS)重懸后備用。同時，調(diào)整真皮細胞與表皮細胞不同的比例，分別為真皮細胞（1×107個）+表皮細胞（5×106個）、真皮細胞(1×107個)+表皮細胞（1×106個）、真皮細胞（1×107個）、真皮細胞（5×106個）+表皮細胞（1×107個）、真皮細胞（1×106個）+表皮細胞（1×107個）、表皮細胞(

10、1×107個)，分別用200μl高糖培養(yǎng)基重懸后備用。用5ml離心管的蓋子制備成小室。取5ml離心管，將蓋子剪下并將其中央部分去掉，在蓋子下端貼一層扎有多個小孔的紙膠布，高壓消毒后備用。受體裸鼠予腹腔注射戊巴比妥鈉0.4 ml/100g(10 mg/ml)麻醉后，以安爾碘消毒背部皮膚3遍，剪刀剪下1塊圓形皮膚，深達肉膜，直徑為小室直徑的一半。把制備好的小室插入到皮膚與肉膜之間，上端暴露于空氣中，將蓋子周邊松弛皮膚縫合固定，形成一個可以容

11、納細胞懸液的開放小室。將細胞混懸液注射至小室內(nèi)，3d后在小室頂部中央剪孔以促使創(chuàng)面干燥，1周后拆去小室。分別于細胞移植后1、2、3、4周大體觀察移植部位毛囊形成、發(fā)育及毛干生長情況。4周后移植部位取材，10％甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，鏡下觀察。細胞移植4周后將移植部位的毛發(fā)全部拔除，觀察毛發(fā)再生情況。⑵取出生后1d內(nèi)C57BL/6J小鼠背部皮膚，并剪成0.5 cm×0.5 cm大小，用0.1％中性蛋白酶4℃消化過夜。PBS（含1

12、％青、鏈霉素）漂洗3次后，將其表皮和真皮分離，真皮剪碎，0.2％Ⅰ型膠原酶37℃消化1h左右，間斷吹打，直到所有組織被消化。加入DMEM高糖培養(yǎng)基（含10％FBS）終止消化。用200目篩網(wǎng)過濾以去除組織碎塊和細胞團塊，將收集的單細胞混懸液于離心管中以1000 r/min離心5min，重復(fù)離心2次，吸去上清液，加入DMEM高糖培養(yǎng)基重懸。將新出生1d內(nèi)的綠色熒光轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠背部皮膚剪成0.5 cm×0.5cm大小，用0.1％

13、中性蛋白酶4℃消化過夜后將其表皮和真皮分離，表皮剪碎，0.2％Ⅰ型膠原酶消化37℃消化1h左右，間斷吹打，直到所有組織被消化。細胞加入DMEM高糖培養(yǎng)基（含10％FBS）終止消化。用200目篩網(wǎng)過濾以去除組織碎塊和細胞團塊，將收集的單細胞混懸液于離心管中以1000 r/min離心5min，重復(fù)離心2次，吸去上清液，加入DMEM高糖培養(yǎng)基重懸。配制DiI儲存液:取5mg DiI避光、37℃溶于20μl DMSO，-20℃凍存。取1μl D

14、iI儲存液加入300μl PBS稀釋后以3000 r/min離心5min,真皮細胞懸液以1000 r/min離心5 min后棄掉上清液加入200μl DiI染液，混勻，染色5-7min后加入PBS清洗并低速離心，細胞沉淀加入DMEM重懸并調(diào)制細胞濃度為1x106個/ml備用。將直徑為2.5mm的硅膠管制備成微型小室，高壓消毒后備用。裸鼠腹腔注射戊巴比妥鈉0.4ml/100g(10mg/ml)麻醉成功后，安爾碘消毒背部皮膚3次，在背部剪下

15、直徑為2mm的圓形皮膚，深達肉膜。把制備好的微型小室插入皮下與肉膜間，上端暴露于空氣中，將小室周邊荷包縫合一圈，防止小室脫落，每只裸鼠移植4個微型小室。細胞以以下組合用20μl高糖培養(yǎng)基重懸后分別注射至微型小室內(nèi)，1周后拆去小室。(i)真皮細胞（5x106個）+表皮細胞（5x106個）;(ii)真皮細胞（2x106個）+表皮細胞（2x106個）;(iii)真皮細胞（1x106個）+表皮細胞（1x106個）;(iv)真皮細胞（5x105個

16、）+表皮細胞（5x105個）;(v)真皮細胞（1x105個）+表皮細胞（1x105個）;(vi）真皮細胞（5x104個）+表皮細胞（5X104個）。另外，分別用DiI標記的真皮細胞（5x105個）+未標記的表皮細胞（5x105個）;GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的表皮細胞（5x105個）+未標記的真皮細胞（5x105個）用微型小室移植。細胞移植后1、2、3、4周，大體觀察移植部位毛囊形成、發(fā)育及毛干生長情況。4周后，移植部位取材，石蠟切片HE染色、冷

17、凍切片熒光檢測和掃描電鏡觀察。將移植部位的毛發(fā)用鑷子直接全部拔除，觀察毛發(fā)再生情況。⑶取出生后1d內(nèi)C57BL/6J小鼠背部皮膚，并剪成0.5 cm×0.5 cm大小，用0.1％中性蛋白酶4℃消化過夜。PBS（含1％青、鏈霉素）漂洗3次后，顯微鑷將其真皮和表皮分離，真皮剪碎，0.2％Ⅰ型膠原酶37℃消化1h左右，間斷吹打，直到所有組織被消化。加入DMEM高糖培養(yǎng)基（含10％FBS）終止消化。用200目篩網(wǎng)過濾，以去除組織碎塊和細胞團塊，

18、將收集的單細胞混懸液于離心管中以1000 r/min離心5min，重復(fù)離心2次，吸去上清液，加入DMEM高糖培養(yǎng)基重懸，臺盼藍染色法檢測細胞存活率。調(diào)整細胞濃度為1x106個/ml，取1ml細胞懸液接種至10cm培養(yǎng)皿中并加入6ml培養(yǎng)基，置于孵箱中培養(yǎng)，24h換液。細胞長至80％融合時傳代培養(yǎng)。表皮用0.25％胰蛋白酶于37℃消化10 min,表皮細胞的制備過程與真皮細胞相似。將27只受體裸鼠隨機分為4組，每只裸鼠背部移植4個微型小室

19、。細胞以以下組合重懸于20μl高糖培養(yǎng)基后移植至微型小室內(nèi)（表皮細胞5x106個;真皮細胞5x106個）。新鮮上皮細胞+新鮮真皮細胞（組1）;新鮮上皮細胞+P0真皮細胞（培養(yǎng)3d，組2）;新鮮上皮細胞+P1真皮細胞（組3）;新鮮上皮細胞+P0真皮細胞（培養(yǎng)過夜，組4）。1周后拆去微型小室。移植后（1、2、3、4周）大體觀察毛囊形成、發(fā)育及毛干生長情況。4周后移植部位取材，10％甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察。
　　

20、 結(jié)果：①細胞移植后1周，創(chuàng)面濕潤無明顯收縮，中央形成淡紅色半透明組織。細胞移植后2周，創(chuàng)面完全愈合。細胞移植后3周，移植部位有黑色毛發(fā)長出皮膚。細胞移植后4周，濃密黑色毛發(fā)垂直于皮膚表面生長，石蠟切片HE染色見毛囊結(jié)構(gòu)發(fā)育完整。將移植部位毛發(fā)拔除后1周能夠再生出新的毛發(fā)。將細胞以不同的比例移植，真皮細胞數(shù)量為1×107而表皮細胞數(shù)量降至1×106時，毛囊重構(gòu)的效率并無明顯改變。表皮細胞數(shù)量為1×107而真皮細胞數(shù)量降至5×106或者

21、更少時，再生毛發(fā)的數(shù)量明顯減少，兩者單獨移植均無毛發(fā)生長。移植部位的毛發(fā)拔除后，毛囊能再生出毛發(fā)并在3w內(nèi)達到原來的長度。②細胞移植4周后可見移植部位有大量黑色毛發(fā)垂直皮膚表面生長。移植的細胞數(shù)量改變時，毛囊重建的效果也隨之改變。當移植的上皮與真皮細胞數(shù)量分別由5x106降低至2x106時，毛囊重建的效果并無明顯改變。但當上皮與真皮分別降低至5x104時，移植部位無毛發(fā)生長，僅有黑色色素沉著。毛發(fā)生長部位取材，石蠟切片HE染色見毛囊結(jié)構(gòu)

22、發(fā)育完整，電鏡掃描見毛發(fā)生長方向規(guī)整，毛發(fā)質(zhì)量優(yōu)異與正常毛發(fā)無明顯差異。冷凍切片熒光檢測見毛囊毛乳頭部位為紅色熒光，毛囊上皮成分為綠色熒光。重建的毛囊能維持至少6個月，毛發(fā)被拔除后毛囊能夠再生出新的毛發(fā)。③新鮮上皮細胞與培養(yǎng)的真皮細胞移植后，組2（新鮮上皮細胞+P0真皮細胞，培養(yǎng)3d）;組3（新鮮上皮細胞+P1真皮細胞）移植部位均未見毛發(fā)生長，僅有黑色色素沉著。移植部位組織學(xué)觀察未見毛囊形成。組4（新鮮上皮細胞+培養(yǎng)過夜的真皮細胞）移植

23、部位可見濃密黑色毛發(fā)長出，與組1（新鮮上皮細胞+新鮮真皮細胞）長出的濃密黑色毛發(fā)外觀無明顯差異。移植部位組織學(xué)觀察見毛囊結(jié)構(gòu)發(fā)育完整。
　　 結(jié)論：⑴新生鼠皮膚細胞以小室法移植后可以構(gòu)建毛囊發(fā)育的完整模型，此模型可用于檢測毛囊細胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力，以及研究毛囊形態(tài)發(fā)生和周期循環(huán)的分子機制。⑵微型小室法毛囊重建模型具有所需細胞量少、創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少、毛囊重建成功率高的優(yōu)點，是一種可靠、實用的毛囊重建模型。尤其是所需細胞量少，一只動物