宿主因素對毛囊重建影響實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前，在體外可構(gòu)建出原始毛發(fā)樣結(jié)構(gòu)。但僅僅實(shí)現(xiàn)由“細(xì)胞—組織”的轉(zhuǎn)變。體外構(gòu)建的毛囊結(jié)構(gòu)形態(tài)較幼稚，需進(jìn)一步移植至體內(nèi)才能發(fā)育成完整毛囊。因此我們不難看出，目前的體外毛囊重建模型仍然太過簡單，不足以為毛囊再生提供適宜的微環(huán)境（細(xì)胞、細(xì)胞因子、信號分子和營養(yǎng)物質(zhì)等），導(dǎo)致體外誘導(dǎo)的毛囊單位形態(tài)不成熟。已有大量研究證實(shí)脂肪細(xì)胞、毛囊間表皮干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等細(xì)胞成分，TGF、VEGF等生長因子及Wnt、BMP等信號分子對毛囊再生有重要作用。但

2、是哪種成分起關(guān)鍵作用仍不得而知。因此我們以經(jīng)酶分離得到的新生鼠的細(xì)胞通過毛囊體內(nèi)重建模型先探究不同宿主對毛囊重建的影響，再研究宿主細(xì)胞是否參與了毛囊重建的過程，最后通過Cell-in-a-box試劑盒隔絕宿主細(xì)胞，探究在沒有宿主細(xì)胞參與的情況下毛囊重建的情況。以期通過上述研究對體外毛囊重建受限做出解釋，探究毛囊重建微環(huán)境，為將來的體外毛囊重建提供指導(dǎo)。
　　一、不同宿主對毛囊重建的影響
　　目的:明確不同宿主對毛囊重建的影響

3、
　　方法:取出生1天內(nèi)的GFP乳鼠，PBS(含1％青鏈霉素)清洗1次，剝離皮膚，PBS（含1％青鏈霉素）清洗3次。0.1％中性蛋白酶4℃消化過夜，將表皮和真皮分離并分別剪碎，真皮用0.2％膠原酶37℃消化1小時(shí)，每15分鐘吹打振蕩1次。表皮用0.25％胰酶37℃消化10分鐘。制備成新鮮分離的真皮和表皮細(xì)胞，加入DMEM高糖培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。取部分真皮、表皮細(xì)胞以2∶1比例混合，表皮細(xì)胞分別為0.1×106個(gè)、0.5×106個(gè)

4、、1.0×106個(gè)、2.5×106個(gè)。同時(shí)，將剩余表皮細(xì)胞與真皮細(xì)胞以不同的比例混合，分別為表皮細(xì)胞0.1×106個(gè)+真皮細(xì)胞1×106個(gè)、表皮細(xì)胞0.5×106個(gè)+真皮細(xì)胞1.0×106個(gè)、表皮細(xì)胞2.5×106個(gè)+真皮細(xì)胞1.0×106個(gè)，表皮細(xì)胞0.5×106個(gè)，真皮細(xì)胞1×106個(gè)，各組細(xì)胞組合均以100ul高糖DMEM重懸，且100ul為1個(gè)單位，備好細(xì)胞懸液待注射。無菌條件下注射于裸鼠及脫去背部毛發(fā)的C57BL/6鼠背部中線

5、兩側(cè)。每只鼠注射6個(gè)點(diǎn)。每天觀察注射部位皮膚的顏色變化。于術(shù)后2、4、7、14、18、21天移植部位取材，隨后每隔3天取材，直至觀察到新生毛囊重新進(jìn)入生長期，體視鏡下觀察，做石蠟、冰凍切片，正置顯微鏡下觀察。取移植后21天形成的毛發(fā)做掃描電鏡檢查。將各細(xì)胞量組合的注射點(diǎn)在14天取材，對形成的毛發(fā)進(jìn)行計(jì)數(shù)
　　結(jié)果:裸鼠和C57BL/6鼠體內(nèi)均可形成新的毛囊，新生毛囊在誘導(dǎo)階段大致相同，4天有黑色毛球形成，7天形成毛干。但C57BL

6、/6鼠新生毛囊在18天進(jìn)入退行期，而裸鼠在21天。C57BL/6鼠新生毛囊在33天重新進(jìn)入生長期，裸鼠則在39天。石蠟切片見再生毛囊結(jié)構(gòu)完整，冷凍切片熒光檢測見明亮綠色熒光。細(xì)胞以不同的比例移植后發(fā)現(xiàn)，C57BL/6鼠體內(nèi)毛囊重建效率高于裸鼠，且二者的真表皮細(xì)胞的最佳比例不同，單一細(xì)胞移植至兩種鼠體內(nèi)時(shí)均無毛發(fā)形成。裸鼠體內(nèi)形成毛發(fā)直徑與正常毛發(fā)相近，但明顯較C57BL/6鼠體內(nèi)形成毛發(fā)直徑粗。
　　結(jié)論:以兩種不同種系的老鼠作為

7、宿主，通過注射法重建毛囊，兩種老鼠體內(nèi)毛囊重建效率不同，且重建毛囊的生長周期和毛干的直徑也有明顯差異，宿主因素對毛囊的形態(tài)發(fā)生有重要影響。
　　二、毛囊重建過程中宿主細(xì)胞的參與情況
　　目的:明確非皮下注射時(shí)宿主細(xì)胞是否參與毛囊重建過程
　　方法:取出生1d內(nèi)RFP乳鼠皮膚，PBS(含1％青鏈霉素)清洗，0.1％中性蛋白酶4℃消化過夜，然后用顯微鑷將表皮和真皮分離并分別剪碎，真皮用0.2％膠原酶37℃消化1h，表皮用0

8、.25％胰酶消化10min。消化結(jié)束后各加入等體積DMEM高糖培養(yǎng)基（含10％胎牛血清）終止消化，制備成新鮮分離的真皮和表皮細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)。將真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞以2∶1的比例混合，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×107/ml，100 ul為1個(gè)單位，備好細(xì)胞懸液待注射。GFP鼠麻醉后去除背部毛發(fā)，常規(guī)消毒，將制備好的細(xì)胞懸液每次1單位，無菌條件下注射至肉膜下，每只鼠注射6個(gè)點(diǎn)作為對照。每天觀察注射部位皮膚的顏色變化，14d后取材，常規(guī)石蠟切片

9、、HE染色、冰凍切片及DAPI染色，鏡下觀察。
　　結(jié)果:注射后第4d可見注射部位皮膚變灰，并有輕微隆起。第8d，皮膚顏色加深，呈黑色。隨后由于RFP鼠自身毛發(fā)生長，不易觀察。第14d取材發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)注射表皮或者真皮細(xì)胞組未見毛發(fā)形成，表皮和真皮細(xì)胞混合注射可見大量毛囊形成，毛囊結(jié)構(gòu)完整。石蠟切片見肉膜完整，新生毛囊位于肉膜下層。冰凍切片及DAPI染色可見新形成的毛囊中大部分為紅色熒光細(xì)胞，少部分為綠色熒光細(xì)胞。
　　結(jié)論:利

10、用兩種表達(dá)不同熒光蛋白的老鼠以注射法重建毛囊，通過觀察熒光細(xì)胞分布，發(fā)現(xiàn)重建的毛囊中有宿主細(xì)胞，即宿主細(xì)胞參與了毛囊重建過程。該方法簡化了操作過程，有較強(qiáng)特異性。但宿主細(xì)胞的具體來源仍不清楚，有待進(jìn)一步的研究。
　　三、宿主細(xì)胞在毛囊重建中的作用
　　目的:驗(yàn)證無宿主細(xì)胞參與下毛囊體內(nèi)構(gòu)建是否能夠完成
　　方法:1.1 將出生1d內(nèi)的GFP、RFP轉(zhuǎn)基因乳鼠處死后，于濃度為75％的乙醇中浸泡20 S后，PBS(含1％青

11、鏈霉素)清洗3次，剪去鼠尾巴和四肢后剝離皮膚，PBS(含1％青鏈霉素)清洗3次。0.1％中性蛋白酶4℃消化過夜，將表皮和真皮分離，并分別剪碎，真皮用0.2％膠原酶37℃消化1h，每15min吹打振蕩1次。表皮用0.25％胰酶37℃消化10min。分別制備成分離的真皮和表皮細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　1.2 囊球的包裹取RFP表皮細(xì)胞0.7×106，GFP真皮細(xì)胞1.4×106，按產(chǎn)品說明包裹細(xì)胞，包裹完成后用無菌的PBS反復(fù)清洗制備

12、的囊球，備用。
　　1.3 囊球的體內(nèi)移植及體外培養(yǎng)將裸鼠常規(guī)麻醉消毒，將含表皮和真皮細(xì)胞的囊球移植于裸鼠皮下，移植空白囊球作為對照，每只裸鼠移植一個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)移植10個(gè)囊球，每組各6只裸鼠。剩余囊球置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為(DMEM+10％FBS∶ Cnt07=2∶1)，將培養(yǎng)皿置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期鏡下觀察囊球中細(xì)胞生長情況。
　　1.4 20天后將部分體外培養(yǎng)的囊球中的細(xì)胞球取出重新接種，觀察細(xì)胞遷出情況

13、;部分細(xì)胞球做常規(guī)石蠟切片，HE染色。剩余囊球繼續(xù)體外培養(yǎng)。10天后將體內(nèi)移植的部分囊球取材，鏡下觀察，將細(xì)胞球取出部分用于做常規(guī)石蠟切片，HE染色。剩余部分囊球繼續(xù)體內(nèi)培養(yǎng)，40天后取材觀察。
　　1.5 將體內(nèi)移植10天后的囊球中的細(xì)胞球重新取出移植到裸鼠體內(nèi)，觀察毛發(fā)形成情況。
　　1.6 用RFP乳鼠真皮和表皮細(xì)胞重復(fù)上述步驟，將體內(nèi)移植10天后的囊球中的細(xì)胞球重新取出移植到GFP鼠體內(nèi)，觀察毛發(fā)形成情況。
　

14、　結(jié)果:包裹的細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)逐漸發(fā)生聚集，形成細(xì)胞球，于包裹后第10天細(xì)胞球形態(tài)趨于穩(wěn)定，石蠟切片未見明顯分化現(xiàn)象。將形成的細(xì)胞球重新接種于培養(yǎng)基中，細(xì)胞球中的細(xì)胞可重新貼壁遷出。移植至裸鼠體內(nèi)的囊球于移植后10天取材，發(fā)現(xiàn)囊球保存完好，未發(fā)生破裂，顯微鏡下見囊球中的細(xì)胞發(fā)生聚集，形成細(xì)胞球，無明顯毛干，石蠟切片可見形成同心圓樣結(jié)構(gòu)。40天時(shí)仍未見明顯毛囊樣結(jié)構(gòu)形成。將體內(nèi)移植的囊球中的細(xì)胞球取出后移植到體內(nèi)可見毛發(fā)形成。移植至轉(zhuǎn)基因鼠