肌腱細(xì)胞體外牽伸模型建立及不同牽伸負(fù)荷對其炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的影響.pdf

1、研究背景：
　　 肌腱病(tendinopathy)是骨科學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和職業(yè)病醫(yī)學(xué)的常見病之一。普遍認(rèn)為肌腱病與肌腱的過度使用(overuse)直接有關(guān),但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。肌腱病發(fā)病機(jī)制目前主要存在兩種截然相反的觀點(diǎn):炎癥介質(zhì)學(xué)說和肌腱退變學(xué)說。支持炎癥介質(zhì)學(xué)說的學(xué)者認(rèn)為肌腱在過度使用后首先產(chǎn)生炎癥介質(zhì),炎癥介質(zhì)導(dǎo)致肌腱組織變性,從而引起肌腱病;而支持肌腱退變學(xué)說的學(xué)者持反對意見,認(rèn)為肌腱病中無炎癥介質(zhì)參與,肌腱病是由肌腱退

2、行性病變引起。本研究擬探討肌腱細(xì)胞在過度牽伸載荷下是否產(chǎn)生炎癥介質(zhì)。
　　 由于體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性及倫理學(xué)相關(guān)問題,直接在體內(nèi)觀察肌腱組織細(xì)胞對機(jī)械應(yīng)力刺激的反應(yīng)及其機(jī)理比較困難,主要依賴體外細(xì)胞牽拉裝置機(jī)械牽拉體外肌腱細(xì)胞以研究肌腱細(xì)胞在過度牽拉下是否有炎癥介質(zhì)產(chǎn)生。但目前體外細(xì)胞牽拉裝置存在以下不足:1.對牽拉的強(qiáng)度及頻率控制范圍窄,自動(dòng)化程度低,需要人工調(diào)節(jié);2.應(yīng)力的施加模式單一,對所有需要牽拉的細(xì)胞實(shí)行單一牽拉模式,不能

3、有效的反應(yīng)不同細(xì)胞在不同牽拉情況下的反應(yīng);3.不能較好的模擬體內(nèi)細(xì)胞排列方向及受力方式進(jìn)行牽拉,影響研究結(jié)果。
　　 研究目的：
　　 根據(jù)體內(nèi)肌腱細(xì)胞排列方向及受力方式,研制一種新型肌腱細(xì)胞循環(huán)牽伸載荷系統(tǒng),建立體外肌腱細(xì)胞過度牽拉模型并予以測試。通過測定過度牽拉負(fù)荷下人肌腱細(xì)胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì):前列腺素E2(PGE2)、白介素1β(IL-1β)和環(huán)氧化酶2(COX-2)的變化,明確炎癥介質(zhì)在肌腱病發(fā)病中的作用。為肌腱病

4、研究提供理想的細(xì)胞牽拉模型及重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法
　　 1.用聚二甲基硅氧烷預(yù)聚物(PDMS)與固化劑以10:1(體積比)制備微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿。對微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿進(jìn)行超大負(fù)荷牽拉,牽拉幅度達(dá)12％,頻率2.0Hz,時(shí)間24小時(shí),觀察培養(yǎng)皿抗?fàn)坷闆r;培養(yǎng)皿表面滴加提高細(xì)胞黏附的纖維結(jié)合素連接蛋白(ProNectin-F)后將人肌腱細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿上,普通培養(yǎng)皿上接種人肌腱細(xì)胞作為對照組,倒置光顯微鏡對比觀察細(xì)

5、胞形態(tài)、存活情況及排列情況;計(jì)數(shù)貼壁存活細(xì)胞數(shù)和接種細(xì)胞數(shù)計(jì)算細(xì)胞貼壁率;
　　 2.利用步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)的機(jī)械力對微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿進(jìn)行單軸動(dòng)力牽拉,可編程控制器配控制循環(huán)載荷牽伸裝置的運(yùn)轉(zhuǎn)速度及時(shí)間,調(diào)節(jié)對培養(yǎng)皿的牽拉頻率和時(shí)間;更換不同大小凸輪對培養(yǎng)皿實(shí)行不同牽拉強(qiáng)度。檢測對新型肌腱細(xì)胞循環(huán)牽伸載荷系統(tǒng)的機(jī)械性能及穩(wěn)定性;初步觀察肌腱細(xì)胞在循環(huán)牽伸載荷下生物學(xué)表現(xiàn);
　　 3.新型肌腱細(xì)胞循環(huán)牽伸載荷系統(tǒng)對體外培養(yǎng)人肌

6、腱細(xì)胞進(jìn)行不同強(qiáng)度及頻率的牽拉。設(shè)定牽拉頻率0.5Hz,牽拉時(shí)間12小時(shí),牽拉后培養(yǎng)24小時(shí),根據(jù)不同牽拉強(qiáng)度設(shè)4％,8％,12％牽拉組,非牽拉組作空白對照,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測不同牽拉強(qiáng)度下前列腺素E2(PGE2)和白介素1β(IL-1β)變化;設(shè)定牽拉強(qiáng)度8％,牽拉時(shí)間12小時(shí),牽拉后培養(yǎng)24小時(shí),根據(jù)不同牽拉頻率設(shè)0.5Hz,1.0Hz,1.5Hz牽拉組,非牽拉組作空白對照,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測

7、不同牽拉頻率下前列腺素E2(PGE2)和白介素1β(IL-1β)變化;設(shè)定牽拉頻率0.5Hz,牽拉時(shí)間4小時(shí),牽拉后培養(yǎng)4小時(shí),根據(jù)不同牽拉強(qiáng)度設(shè)4％,8％,12％牽拉組,非牽拉組作空白對照,蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Westem blot)檢測不同牽拉強(qiáng)度下人肌腱細(xì)胞COX-2蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿參數(shù):微槽寬和槽間橋?qū)捑鶠?0μm,槽深3μm,培養(yǎng)皿表面積為3cm×6cm。微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿在

8、超大負(fù)荷下牽拉下無斷裂及撕裂,彈性良好;微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿上肌腱細(xì)胞生長及貼壁良好,細(xì)胞呈平行排列,與體內(nèi)肌腱細(xì)胞排列方向類似,而光滑面培養(yǎng)上肌腱細(xì)胞排列雜亂無章;肌腱細(xì)胞在微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿和普通培養(yǎng)皿上細(xì)胞貼壁率無明顯差別;
　　 2.新型肌腱細(xì)胞循環(huán)牽伸載荷系統(tǒng)通過更換不同凸輪大小,能實(shí)現(xiàn)不同牽拉強(qiáng)度2％,4％,8％,12％控制;電子控制頻率可調(diào)節(jié)范圍為:0.1-2Hz,可調(diào)節(jié)量為:0.1Hz,時(shí)間可調(diào)節(jié)范圍為0-24小時(shí)

9、,可調(diào)節(jié)量為:1分鐘;該系統(tǒng)能按預(yù)定的強(qiáng)度、頻率及時(shí)間對微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿進(jìn)行牽拉,運(yùn)行良好且穩(wěn)定;
　　 3.牽拉頻率0.5Hz,牽拉時(shí)間12小時(shí),4％牽拉組,8％牽拉組,12％牽拉組,非牽拉組PGEz量分別為:499.97±73.71pg/萬個(gè)細(xì)胞,559.11±55.89pg/萬個(gè)細(xì)胞,1132.84±42.24Pg/萬個(gè)細(xì)胞,1507.72±40.86 pg/萬個(gè)細(xì)胞,IL-1β濃度分別為:6.35±0.64pg/ml,

10、7.52±0.66pg/ml,8.88±1.21pg/ml,16.64±3.25pg/ml,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,PGE2在8％和12％牽拉強(qiáng)度時(shí)明顯增加(P＜0.05);而IL-1β在12％牽拉強(qiáng)度下明顯增高(P＜0.05)。牽拉強(qiáng)度8％,牽拉時(shí)間12小時(shí),0.5Hz牽拉組,1.0Hz牽拉組,1.5Hz牽拉組,非牽拉組PGE2量分別為:645.31±24.76pg/萬個(gè)細(xì)胞,1038.162±42.41pg/萬個(gè)細(xì)胞,1649.06±265.

11、30pg/萬個(gè)細(xì)胞,1756.70±250.68pg/萬個(gè)細(xì)胞,IL-1β濃度分別為:6.88±1.91pg/ml,9.54±0.15pg/ml,13.80±3.63pg/ml,15.88±3.5pg/ml,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,PGE2產(chǎn)生的量,0.5Hz牽拉組,1.0Hz牽拉組,1.5Hz牽拉組與非牽拉組相比明顯增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而IL-1β在1.5Hz牽拉頻率下比非牽拉組明顯增高(P＜0.05)。人肌腱細(xì)胞COX-2蛋白

12、表達(dá)情況:4％、8％、12％牽拉組灰度值逐漸增加,與非牽拉組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿彈性良好,能滿足不同牽拉強(qiáng)度、頻率和時(shí)間的需要,培養(yǎng)皿經(jīng)消毒后可以反復(fù)使用;微溝槽硅樹脂培養(yǎng)皿上人肌腱細(xì)胞生長及貼壁生長良好,肌腱細(xì)胞呈平行排列,與體內(nèi)類似;
　　 2.新型肌腱細(xì)胞循環(huán)牽伸載荷系統(tǒng)是一個(gè)好的體外肌腱細(xì)胞牽伸載荷模型,具有運(yùn)行穩(wěn)定,可控性強(qiáng)等特點(diǎn);
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