不同載荷機(jī)械牽伸通過mTORC1信號(hào)通路調(diào)節(jié)肌腱異位骨化.pdf

1、本研究課題設(shè)計(jì)為:體外分離培養(yǎng)大鼠跟腱來源的肌腱干細(xì)胞，并在Flexcell FX-5000應(yīng)力加載系統(tǒng)中進(jìn)行不同幅度的牽伸，分別應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測牽伸后肌腱干細(xì)胞的成骨分化相關(guān)因子Runx2和OSX的表達(dá)情況。加入mTORC1特異性抑制劑雷帕霉素抑制肌腱干細(xì)胞中的mTORC1信號(hào)通路，在機(jī)械牽伸后，分別應(yīng)用Real-time PCR檢測Runx2和OSX的表達(dá)情況，明確牽伸情況下mTORC1信

2、號(hào)通路在肌腱干細(xì)胞異常成骨分化中的作用。除了對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同幅度機(jī)械牽伸，筆者還建立了可模擬不同牽伸負(fù)荷的動(dòng)物模型。在前人研究異位骨化的動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，筆者應(yīng)用石膏固定模擬不同幅度的牽伸。通過免疫組化染色和Micro CT掃描檢測應(yīng)力對(duì)于異位骨化的影響。給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射雷帕霉素抑制體內(nèi)mTORC1信號(hào)通路，研究mTORC1信號(hào)通路在肌腱異位骨化中的作用。根據(jù)以上假設(shè)，筆者將課題研究分三部分。
　　1.不同載荷機(jī)械牽伸對(duì)跟腱干細(xì)胞成

3、骨分化及跟腱異位骨化的影響
　　1.1 分別從基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平兩個(gè)方面著手，研究肌腱干細(xì)胞在不同牽伸條件下，成骨分化指標(biāo)Runx2和OSX的表達(dá)水平及變化趨勢。
　　1.2 實(shí)驗(yàn)分組:無牽伸對(duì)照組(NS)，4％牽伸強(qiáng)度組(4％)，12％牽伸強(qiáng)度組(12％)。
　　1.2.1 不同牽伸強(qiáng)度對(duì)Runx2和OSX基因表達(dá)水平影響
　　應(yīng)用Real-time PCR檢測不同牽伸條件下跟腱細(xì)胞RUNX2和OSX基

4、因的表達(dá)量，結(jié)果顯示，4％機(jī)械應(yīng)力刺激下跟腱細(xì)胞RUNX2和OSX基因表達(dá)較未經(jīng)機(jī)械應(yīng)力刺激的細(xì)胞顯著下降(P＜0.05);12％機(jī)械應(yīng)力刺激下跟腱細(xì)胞RUNX2和OSX基因表達(dá)較未經(jīng)機(jī)械應(yīng)力刺激的細(xì)胞顯著升高(P＜0.05)。
　　1.2.2 不同牽伸強(qiáng)度對(duì)Runx2和OSX蛋白表達(dá)水平影響
　　應(yīng)用Westemb1ot檢測不同牽伸條件下跟腱細(xì)胞RUNX2和OSX蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示，4％機(jī)械應(yīng)力刺激下跟腱細(xì)胞RUNX2

5、和OSX蛋白表達(dá)較未經(jīng)機(jī)械應(yīng)力刺激的細(xì)胞顯著下降(P＜0.05);12％機(jī)械應(yīng)力刺激下跟腱細(xì)胞RUNX2和OSX蛋白表達(dá)較未經(jīng)機(jī)械應(yīng)力刺激的細(xì)胞顯著升高(P＜0.05)。
　　1.2.3 應(yīng)用HE染色及Micro CT掃描檢測不同牽伸強(qiáng)度對(duì)跟腱異位骨化的影響
　　1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組:無牽伸對(duì)照組(Ctrl)，低幅度牽伸組(LE)，高幅度牽伸組(HE)。
　　1.2.2 不同牽伸強(qiáng)度對(duì)跟腱異位骨化的影響
　　1.

6、2.3 Ctrl組、LE組和HE組大鼠右側(cè)跟腱HE染色顯示，三組跟腱均有異位骨化發(fā)生，出現(xiàn)骨髓腔，成骨樣細(xì)胞。LE組較Ctrl組異位骨化程度輕，而HE組較Ctrl組及LE組異位骨化程度要中重。Ctrl組、LE組和HE組大鼠右下肢Micro CT掃描顯示，LE組異位骨化BV/TV、Tb.N、Tb.T數(shù)值均較Ctrl組顯著下降(P＜0.05);HE組組異位骨化BV/TV、Tb.N、Tb.T數(shù)值均較Ctrl組顯著升高(P＜0.05)。

7、　　2.不同幅度機(jī)械應(yīng)力對(duì)跟腱細(xì)胞及大鼠跟腱mTORC1信號(hào)通路的影響
　　2.1 從蛋白表達(dá)水平著手，研究肌腱于細(xì)胞在不同牽伸條件下，磷酸化p70s6k的表達(dá)水平及變化趨勢。
　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)分組:無牽伸對(duì)照組(NS)，4％牽伸強(qiáng)度組(4％)，12％牽伸強(qiáng)度組(12％)。
　　2.2.2 機(jī)械牽伸對(duì)肌腱干細(xì)胞中磷酸化p70s6k蛋白表達(dá)水平的影響
　　應(yīng)用Western blot檢測不同牽伸條件下跟腱細(xì)胞p

8、-P70S6K蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示，4％機(jī)械應(yīng)力刺激下跟腱細(xì)胞p-P70S6K蛋白表達(dá)較未經(jīng)機(jī)械應(yīng)力刺激的細(xì)胞顯著下降(P＜0.05);12％機(jī)械應(yīng)力刺激下跟腱細(xì)胞p-P70S6K蛋白表達(dá)較未經(jīng)機(jī)械應(yīng)力刺激的細(xì)胞顯著升高(P＜0.05)。
　　2.2.3 應(yīng)用免疫組化染色檢測不同牽伸強(qiáng)度對(duì)跟腱磷酸化p70s6k表達(dá)水平的影響
　　2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組:無牽伸對(duì)照組(Ctrl)，低幅度牽伸組(LE)，高幅度牽伸組(HE)。<

9、br>　　2.2.2 不同牽伸強(qiáng)度對(duì)跟腱mTORC1信號(hào)通路的影響各組大鼠右側(cè)跟腱免疫組化染色顯示，LE組跟腱細(xì)胞磷酸化p70s6k蛋白表達(dá)量較Ctrl組顯著下降(P＜0.05);HE組跟腱細(xì)胞磷酸化p70s6k蛋白表達(dá)量較Ctrl組及LE組顯著升高(P＜0.05)。
　　3.抑制mTORC1信號(hào)通路對(duì)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的跟腱細(xì)胞成骨分化和跟腱異位骨化的影響。
　　3.1 蛋白表達(dá)水平方面著手，研究肌腱干細(xì)胞在不同牽伸條件下以及雷

10、帕霉素干預(yù)下，成骨分化指標(biāo)Runx2和OSX的表達(dá)水平及變化趨勢。
　　3.2 實(shí)驗(yàn)分組:無牽伸對(duì)照組(NS)，4％牽伸強(qiáng)度組(4％)，4％牽伸強(qiáng)度加雷帕霉素組(4％+Rapa)，12％牽伸強(qiáng)度組(12％)，12％牽伸強(qiáng)度加雷帕霉素組(12％+Rapa)。
　　3.2.2 不同牽伸強(qiáng)度及雷帕霉素干預(yù)對(duì)Runx2和OSX蛋白表達(dá)水平影響
　　應(yīng)用Western blot檢測雷帕霉素對(duì)不同牽伸條件下跟腱細(xì)胞RUNX2和OS

11、X蛋白表達(dá)的影響。未經(jīng)機(jī)械應(yīng)力牽伸的NS組及NS+Rapa組，NS+Rapa組RUNX2和OSX蛋白表達(dá)量較NS組顯著下降(P＜0.05)。4％機(jī)械應(yīng)力刺激下的4％組和4％+Rapa組，4％+Rapa組RUNX2和OSX蛋白表達(dá)量較4％組顯著下降(P＜0.05)。12％機(jī)械應(yīng)力刺激下的12％組和12％+Rapa組，12％+Rapa組RUNX2蛋白表達(dá)量較4％組顯著升高(P＜0.05)。
　　3.2.3 應(yīng)用免疫組化染色檢測不同牽伸

12、強(qiáng)度及雷帕霉素干預(yù)對(duì)跟腱異位骨化的影響
　　3.2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組:無牽伸對(duì)照組（Ctrl），無牽伸對(duì)照加雷帕霉素組(Ctrl+Rapa)，低幅度牽伸組(LE)，低幅度牽伸加雷帕霉素組(LE+Rapa)，高幅度牽伸組(HE)，高幅度牽伸加雷帕霉素組(HE+Rapa)。
　　3.2.3.2 不同牽伸強(qiáng)度及雷帕霉素干預(yù)對(duì)跟腱異位骨化的影響
　　各組大鼠右側(cè)跟腱免疫組化染色顯示，Ctrl+Rapa組跟腱細(xì)胞RUNX2和OS

13、X蛋白表達(dá)量較Ctrl組顯著下降(P＜0.05);LE+Rapa組跟腱細(xì)胞RUNX2和OSX蛋白表達(dá)量較LE組顯著下降(P＜0.05); HE+Rapa組跟腱細(xì)胞RUNX2和OSX蛋白表達(dá)量較HE組顯著下降(P＜0.05)。
　　本研究采用Flexcell FX-5000應(yīng)力加載系統(tǒng)，選用4％、12％牽伸應(yīng)變量，每天牽伸8小時(shí)，模擬反復(fù)機(jī)械牽伸所導(dǎo)致肌腱病的慢性損傷過程，觀察肌腱干細(xì)胞在不同牽伸狀態(tài)下成骨分化的情況。此外，加入mT

14、ORC1特異抑制劑雷帕霉素，觀察mTORC1被抑制后機(jī)械應(yīng)力對(duì)跟腱干細(xì)胞成骨分化的影響。筆者發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素加強(qiáng)了4％機(jī)械牽伸抑制跟腱干細(xì)胞成骨分化的作用;同時(shí)，雷帕霉素也減弱了12％機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)跟腱干細(xì)胞成骨分化的作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建了承受不同機(jī)械應(yīng)力的大鼠模型，用腹腔注射雷帕霉素的方法抑制mTORC1信號(hào)通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素加強(qiáng)了低幅度機(jī)械牽伸抑制跟腱異位化的作用;同時(shí)，雷帕霉素也減弱了高幅度機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)跟腱異位骨化的作用。細(xì)