精原干細(xì)胞mTORC1信號通路在精子發(fā)生中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、目的：
　　哺乳動物雷帕霉素功能性靶蛋白(mechanistic target ofrapamycin，mTOR)是一個非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，一般形成兩種不同的復(fù)合物，它們分別是mTORC1和mTORC2，各自行使功能。結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體(Tuberous sclerosis complex，TSC)是mTORC1重要的上游調(diào)節(jié)因子，抑制mTORC1的活性。mTORC1活化使其下游核糖體蛋白S6激酶(S6K)磷酸化和轉(zhuǎn)錄起

2、始因子4E結(jié)合蛋白(4E-BP1)磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白翻譯和核糖體發(fā)生。
　　小鼠睪丸是重要的雄性生殖器官，是產(chǎn)生精子和雄性激素的場所，對雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育起著非常重要的作用。精原干細(xì)胞經(jīng)過有絲分裂、分化、減數(shù)分裂形成高度分化的精子。
　　越來越多的證據(jù)表明，mTORC1在個體的發(fā)育過程中扮演重要角色。但是其在小鼠睪丸發(fā)育過程中的具體作用還不清楚。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，mTORC1活性在C57BL/6小鼠睪丸發(fā)育過程中呈現(xiàn)

3、趨勢性變化，可見mTORC1活性與小鼠睪丸發(fā)育存在聯(lián)系。進(jìn)一步探究其在睪丸發(fā)育和精子發(fā)生中的作用機(jī)制，為臨床上預(yù)防和治療男性不育癥提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、基因敲除小鼠的構(gòu)建與繁殖。成功構(gòu)建睪丸精原細(xì)胞敲除Tsc1的小鼠模型，繁殖出雄性實(shí)驗(yàn)鼠Vasa-Cre-Tsc1flox/flox，同窩出生的不帶有Cre的雄性Tsc1flox/flox小鼠作為對照鼠。
　　2、用PCR和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行小鼠基因型的鑒定

4、，Tsc1敲除效果用western blot方法確定。
　　3、免疫組織化學(xué)染色和western blot檢測小鼠睪丸組織p-S6、p-mTOR表達(dá)，判斷Tsc1敲除后mTORC1的活化情況。
　　4、通過HE染色檢測敲除鼠睪丸生精小管的變化情況。
　　5、通過TUNEL染色檢測敲除鼠睪丸內(nèi)細(xì)胞凋亡情況。
　　6、Q-PCR、免疫組化染色和western blot檢測小鼠睪丸內(nèi)增殖分化指標(biāo)分子在對照鼠和敲除鼠中的

5、差異情況，探究敲除鼠表型背后的機(jī)制。
　　7、精子計(jì)數(shù)，檢測敲除鼠相對于對照鼠精子發(fā)生情況。
　　8、用3mg/kg/d濃度劑量氯化鎘腹腔注射2月齡小鼠，連續(xù)注射三天，建立小鼠睪丸損傷模型。
　　9、HE染色、免疫組化染色和western blot檢測氯化鎘處理小鼠睪丸mTOR相關(guān)信號蛋白的表達(dá)情況，探究其作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、Tsc1敲除鼠睪丸萎縮，生精細(xì)胞層變薄
　　相對于對照鼠，敲除鼠

6、睪丸質(zhì)量(mg)下降（58.33±1.53vs99.67±2.52，P＜0.05），敲除鼠睪丸生精細(xì)胞層數(shù)減少。
　　2、Tsc1敲除鼠睪丸凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，出現(xiàn)少精癥
　　相對于對照鼠，敲除鼠睪丸凋亡細(xì)胞數(shù)（NO./mm2）明顯多于對照鼠（287.33±6.43vs151.00±3.61，P＜0.05），附睪內(nèi)精子數(shù)目(106/epididymis)減少（5.02±0.38vs11.10±0.02,P＜0.05）。

7、>　　3、Tsc1敲除鼠睪丸精原細(xì)胞分化異常，進(jìn)而引起睪丸發(fā)育異常
　　Q-PCR結(jié)果顯示:相對于對照鼠，3周齡敲除鼠Zbtb16（精原細(xì)胞未分化指標(biāo)分子）mRNA水平下降50％左右(P＜0.05)，Stra8、c-Kit（精原細(xì)胞分化指標(biāo)分子）mRNA水平上升2倍左右(P＜0.05)。WB結(jié)果顯示:2月齡敲除鼠Zbtb16蛋白表達(dá)下降，Stra8蛋白表達(dá)上升。IHC結(jié)果顯示:2月齡敲除鼠Stra8蛋白表達(dá)上升。我們得出結(jié)論，敲除

8、鼠精原細(xì)胞分化異常，引起睪丸發(fā)育異常。
　　4、氯化鎘處理后，小鼠睪丸出現(xiàn)損傷，E-Cadherin下降，mTORC1活性上升，mTOR信號通路參與其中
　　HE結(jié)果顯示:氯化鎘處理小鼠睪丸損傷，附睪內(nèi)精子數(shù)目減少，E-Cadherin下降，p-S6水平上升，mTORC1活性上升。
　　結(jié)論：
　　mTORC1信號通路對維持精原干細(xì)胞自我更新具有重要作用，mTORC1持續(xù)活化會加快精原干細(xì)胞分化，精原干細(xì)胞提前耗