抑制體外擴增小鼠造血干細胞衰老維持干性-下調異常激活的mTORC1信號.pdf

1、第一部分mTORC1在造血干細胞體外擴增過程中的活化規(guī)律
　　 目的：mTORC1 掌控了細胞多種生命過程，研究表明過高的mTORC1 活性會破壞細胞內壞境平衡。本研究的目的是探討造血干細胞在體外擴增過程中，胞內的mTORC1 活性的變化規(guī)律。
　　 方法：分選小鼠骨髓Lin-Sca-1+細胞，應用無血清培養(yǎng)基添加細胞因子的培養(yǎng)體系體外擴增分選的干祖細胞，應用Rapamycin 作為mTORC1 抑制劑，以DMSO 作為

2、對照。擴增10天，在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后，收集擴增后細胞，流式檢測胞內mTORC1 底物p70 s6k 磷酸化狀況。
　　 結果：Lin-Sca-1+細胞在細胞因子的刺激下開始增殖，第6天時細胞擴增了25±4.5倍，到了第10天時，細胞擴增了82±5.2 倍。磷酸化p70 s6k的表達與之相應。在未擴增初始的狀態(tài)下，只有5.82±3.12％的細胞表達磷酸化p70 s6k，擴增了6天以后，22.4±

3、4.67％的細胞表達磷酸化p70 s6k，而擴增了10天以后，73.4±5.23％的細胞表達磷酸化p70 s6k；在第6天的時候加入Rapamycin 可以有效的抑制磷酸化p70s6k的表達，但是并沒有完全抑制磷酸化p70 s6k的表達。
　　 結論：mTORC1在10天的小鼠造血干細胞體外擴增過程當中，前6天呈現一定水平的激活，在擴增的第7-10天呈現一個劇烈激活的過程，這個過程和總細胞的大量擴增相呼應。
　　 第二部

4、分抑制mTORC1 異?；钚源龠M造血干細胞體外擴增以及干性維持
　　 目的：mTORC1 過高活性會導致造血干細胞池的耗竭，而Rapamycin 為m TORC1 有效抑制劑。在上一部分的研究中已經發(fā)現mTORC1在擴增7-10天出現劇烈激活過程，本部分研究目的就是利用Rapamycin 抑制mTORC1在小鼠造血干細胞擴增第7-10天呈現的劇烈激活，研究其能否進造血干細胞體外擴增以及干性維持。
　　 方法：分選小鼠骨髓

5、Lin-Sca-1+細胞，應用無血清培養(yǎng)基添加細胞因子的培養(yǎng)體系體外擴增分選的干祖細胞，應用Rapamycin 作為mTORC1 抑制劑，以DMSO 作為對照。擴增10天，在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后，收集擴增后細胞。利用流式檢測細胞的表型，利用CAFCs（Cobblestone Area-Forming Cells）法檢測體外造血干細胞的功能，利用競爭性移植的辦法檢測造血干細胞長期造血能力。
　　 結

6、果：Rapamycin在第6天加入，在擴增結束以后，會略微的減少有核細胞總的數量，Veh組總的有核細胞數量為2.73±0.33×105，而加Rapamycin組總的有核細胞數量為2.43±0.21×105。但是Rapamycin的加入卻增高了LSK+細胞和Lin-Sca-1+細胞在總細胞中的比例，通過計算得出總的LSK+細胞和Lin-Sca-1+細胞的數量，我們發(fā)現，Rapamycin 相較于Veh可以顯著的增加LSK+細胞和Lin-S

7、ca-1+細胞的數量，Veh組分別得到1.27±0.47×104和7.34±3.0×103的Lin-Sca-1+細胞和LSK+細胞，而Rapamycin組則得到1.97±0.56×104和10.64±3.42×103的Lin-Sca-1+細胞和LSK+細胞。當與初始的Lin-Sca-1+細胞比較，計算Lin-Sca-1+細胞擴增的倍數時，Veh組獲得了4.2倍的擴增，而Rapamycin 獲得了6.5倍的擴增。Rapamycin 相較于

8、Veh獲得了1.5倍的Lin-Sca-1+細胞數量。Rapamycin 可以明顯的增加day14-CAFCs和day35-CAFCs，可以獲得150.67±16.4和9.26±1.45/100，000細胞的day14-CAFCs和day35-CAFCs，而Veh則只能獲得97.3±7.6和3.53±1.02/100，000細胞的day14-CAFCs和day35-CAFCs。當計算day35-CAFCs擴增倍數時，即相當于計算體外造血干

9、細胞功能時，Veh獲得了0.73±0.08倍的擴增，而Rapamycin 獲得了1.95±0.25倍的擴增。Rapamycin 擴增后的細胞相較于Veh擴增后的細胞在第8周的時候，能更有效的植入照射模型的小鼠體內Rapamycin組CD45.2細胞的植入率為32.23±10.7％，Veh組的植入率為18.16±9.32％；隨著時間的延長至32周，Veh組的植入率有所降低，9.93±8.25％，而Rapamycin組的植入率為42.1±1

10、1.2％。
　　 結論：Rapamycin 能夠促進體外造血干細胞的擴增，并且增強擴增后細胞造血重建的速度和長期造血重建功能，維持其干性。
　　 第三部分抑制mTORC1 異?；钚源龠M造血干細胞體外擴增的機制探討
　　 目的：雖然明確了抑制mTORC1異常活性可以促進造血干細胞體外擴增以及干性維持，但是其機制尚不清楚。在其他細胞環(huán)境的研究發(fā)現mTORC1活性與干細胞的凋亡，分化，衰老密切相關，本研究的目的是探討抑

11、制mTORC1活性促進造血干細胞體外擴增及干性維持的機制。
　　 方法：分選小鼠骨髓Lin-Sca-1+細胞，應用無血清培養(yǎng)基添加細胞因子的培養(yǎng)體系體外擴增分選的干祖細胞，應用Rapamycin 作為mTORC1抑制劑，以DMSO作為對照。擴增10天，在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后，收集擴增后細胞。利用流式，免疫熒光，細胞組織化學，聚合酶鏈式反應檢測細胞的周期，衰老等相關分子表達。
　　 結果：通

12、過Annexin-V對凋亡細胞的標記,發(fā)現Veh組的總細胞Annexin-V表達率為8.93±1.5％，Rapamycin組的總細胞Annexin-V表達率為11.79±3.7％；在LSK+的細胞群體當中，Annexin-V表達率在Veh組和Rapamycin組分別為2.61±0.57％和2±0.22％。通過CFCs（cloning forming cells）檢測發(fā)現Rapamycin 對于粒-巨細胞形成集落，爆式紅細胞集落的生成沒有

13、顯著的影響。對衰老表型的研究發(fā)現，在未擴增的對照的細胞中，幾乎沒有發(fā)現衰老的細胞，細胞在Veh的處理下，擴增了10天以后，Lin-Sca-1+細胞出現了9.7±1.95％的衰老細胞，但是Rapamycin 非常明顯的抑制了衰老細胞出現的頻率，為2.4±0.71％。對自噬的研究發(fā)現，經過Rapamycin 處理以后，自噬標志性分子LC3b的表達面積顯著低于Veh組，甚至比未擴增的細胞還要低；對細胞周期的研究發(fā)現，Rapamycin 處理顯

14、著的增加了G0期細胞的比例，Veh組的G0期細胞的比例為11.75±3.3％，Rapamycin組的G0期細胞的比例為21.7±3.5％。不僅如此，Rapamycin的處理還減低了p16和p53的表達。
　　 結論：抑制mTORC1活性并沒有影響造血干細胞的凋亡和分化，而顯著降低了其在擴增過程中出現的衰老。Rapamycin 并沒有通過增強自噬來抑制衰老，而是通過調節(jié)了一系列的細胞周期動力因子和阻滯因子實現了對衰老的抑制。

15、>　　 第四部分mTORC1和p38 MAPKα在造血干細胞體外擴增過程中的相互對話關系
　　 目的：在以前的研究中發(fā)現了抑制p38 MAPKα的活性可以通過抑制衰老促進造血干細胞的體外擴增，而在這里發(fā)現了抑制mTORC1的活性也是主要通過抑制衰老的作用而促進了造血干細胞的體外擴增，那么兩者的關系究竟如何呢？在這部分的研究當中對mTORC1和p38 MAPKα相互對話關系進行了深入的探討和研究。
　　 方法：分選小鼠骨

16、髓Lin-Sca-1+細胞，應用無血清培養(yǎng)基添加細胞因子的培養(yǎng)體系體外擴增分選的干祖細胞，應用Rapamycin 作為mTORC1 抑制劑，SB(SB203580)作為p38 MAPKα的抑制劑，以DMSO 作為對照。擴增10天，SB 從第一天開始加，在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后，收集擴增后細胞。通過免疫印跡，免疫熒光，聚合酶鏈式反應等方法檢測相關分子表達情況。
　　 結果：在造血干細胞體外擴增過程當中

17、，抑制mTORC1 對p38 MAPKα沒有影響，但是抑制p38 MAPKα活性會反而增強mTORC1的活性。聯合抑制mTORC1和p38 MAPKα可以進一步促進造血干細胞的體外擴增。四組比較發(fā)現，Veh組獲得了1.5±0.3×103，Rapamycin組獲得了1.9±0.1×103，SB組獲得了2.2±0.2×103，聯合處理組獲得了2.6±0.14×103的LSK+細胞，以及更多的day35CAFCs，分別為3.4±0.57，7.

18、8±0.32，9.7±0.21，11.4±0.63/100，000個擴增細胞。聯合抑制mTORC1和p38 MAPKα，通過對SA-β-gal的研究發(fā)現SB和Rapamycin的聯合應用明顯的進一步降低了衰老表型的表達，只有1.9±0.7％，而單獨加入Rapamycin或者SB 則有4.3±2.1％，5.2±1.6％，聯合抑制以后p16和p53的表達進一步降低，只有Veh組的0.37±0.05，0.45±0.08 倍。
　　 結