人眼小梁細(xì)胞體外培養(yǎng)及TNF-α對其表達(dá)MMPs的影響.pdf

1、目的：探討體外培養(yǎng)人眼小梁細(xì)胞(humantrabecularcells，HTCs)的方法，觀察其生物學(xué)特性。并在此基礎(chǔ)上研究腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)對體外培養(yǎng)的HTCs基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-3、MMP-9)表達(dá)的影響、意義及核因子-KB(Nuclearfactor-KappaB，NF—KB)的特異抑制劑……二硫氨基甲酸吡啶(Pyrollidinedithocarba-mate，PDT

2、C)對其表達(dá)的影響。 方法：(1)采用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行體外HTCs的培養(yǎng)，運(yùn)用二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽([3一(4，5-dimethylthiazol2-y1)一2,5-di曲enyltetrazoliumbromide】，MTT)比色法、倒置顯微鏡、透射電鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)法等方法觀察體外培養(yǎng)的HTCs的生物學(xué)特性并進(jìn)行鑒定。(2)采用RT-PCR法和酶譜分析法(zymography)檢測體外培養(yǎng)的HTCs經(jīng)0．0ng／ml(對

3、照組)、1ng/ml、10ng／ml、25ng／mHNF—a處理24h后，細(xì)胞表達(dá)MMP-3、MMP-9的量；運(yùn)用NF—KB的特異抑制劑二硫氨基甲酸吡啶(Pyrollidinedithocarba-mate，PDTC)抑制NF—KB的活化，觀察不同濃度TNF—Q對體外培養(yǎng)的HTCsMMP-3，一9表達(dá)的影響。 結(jié)果：(1)組織塊培養(yǎng)10—15天后可見細(xì)胞從其邊緣向外生長，倒置顯微鏡下成梭形、圓形、橢圓形、并有多個突起，電鏡可見H

4、TCs表面有較多的微絨毛，細(xì)胞間縫隙連接，胞質(zhì)內(nèi)見很多次級溶酶體。(2)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測纖維粘連蛋白(fibronectin,FN)、層粘連蛋白(1aminin,LN)和神經(jīng)元烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)染色陽性，傳三代細(xì)胞均表現(xiàn)為胞漿呈紅色。(3)利用KF-PCR法檢測1ng／ml、10n/ml、25ng／ml的TNF—Q實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MNIP-3／β-actin吸光度比值分別為0．88±0．02，1．

5、02±0．01，1．20±0．02，各實(shí)驗(yàn)組與對照組0．65±0．01相比，P<0．05均有顯著性差異，另10ng／ml、25ng／ml的TNF-α．實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞提前30min加入PDTC(100gM)，MMP-3／β-actin吸光度比值分別為0．78±0．07，0．87±0．03，分別較未加入PDTC組有顯著性差異(P<0．05)：lng／ml、10ng／ml、25ng／ml的TNF一α實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MMP-9／B—actin吸光度比值分

6、別為0．94±0．01，0．97±0．05，1．13±0．02，各實(shí)驗(yàn)組與對照組0．75±0．02相比，P<0．05均有顯著性差異，另10ng／ml、25ng／ml的TNF-α實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞提前30min加入PDTC(100gM)，MMP-9／B。actin吸光度比值分別為0．78±0．05，1．02±0．01，分別較未加入PDTC組有顯著性差異(P<0．05)。(4)酶譜分析法(zymography)檢測1ng／ml、10ng／m!、25

7、ng／ml的TNF-Q實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MMP-3條帶酶解量分別為114．55±5．62，216．10±n．21，276．86±17．97，各實(shí)驗(yàn)組與對照組94．31±3．69相比，P<0．05均有顯著性差異，另10ng／mt、25ng／ml的TNF-α實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞提前30min加入PDTC(1001~M)，MMP-3條帶酶解量分別為99．18±8．19，125．75±5．66，分別較未加入PDTC組有顯著性差異(P<0．05)；lng／mi、1

8、0ng／ml、25ng／ml的TNF—Q實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MMP-9條帶酶解量分別為443．4±24．46，497．44±19．20，590．53±24．83，各實(shí)驗(yàn)組與對照組319．25±32．53相比，P<0．05均有顯著性差異，另10ng／ml、25ng／ml的TNF-α實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞提前30min加入PDTC(100gM)，MMP-9條帶酶解量分別為349．15±24．21，456．62±34．12，分別較未加入PDTC組有顯著性差異(P<

9、0．05)。 結(jié)論：(1)掌握細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)和人眼小梁細(xì)胞(HTCs)生長特點(diǎn)、超微結(jié)構(gòu)及免疫細(xì)胞化學(xué)染色等特點(diǎn)，能夠成功地進(jìn)行體外HTCs的培養(yǎng)，并且可以確定本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞為正常HTCs。(2)體外培養(yǎng)的HTCs能夠表達(dá)MMP-3，MMP-9。(3)TNF．a(chǎn)可調(diào)節(jié)HTCsMMP-3及MMP-9的表達(dá)，TNF，Q通過活化NF-KB啟動MMP-3，MMP-9的轉(zhuǎn)錄，但除了有NF—KB參與MMP一3、MMP-9轉(zhuǎn)錄的啟動外，