骨不連細(xì)胞體外培養(yǎng)及壓應(yīng)力刺激對(duì)其成軟骨分化影響的研究.pdf

1、目的:
　　探討骨不連瘢痕組織中是否存在一種細(xì)胞(NCs)，具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性以及壓應(yīng)力刺激對(duì)NCs成軟骨分化的影響。
　　方法:
　　1.骨不連細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　收集人的骨不連瘢痕組織，采用組織塊培養(yǎng)法并結(jié)合傳代獲取、純化細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志物的表達(dá)，從而對(duì)其鑒定。MTT法測(cè)定第3、5、9代細(xì)胞的增殖情況。
　　2.骨不連細(xì)胞的多分化潛能的研究
　　取生長(zhǎng)良好的第3代到第5代的細(xì)

2、胞，分別用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基及成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。于成骨誘導(dǎo)7天，行Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色，于誘導(dǎo)14天，Western-blot檢測(cè)ALP，OC，BSP的蛋白含量，于誘導(dǎo)21天，行茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色;于成脂誘導(dǎo)14天，行油紅O染色，并Western-blot檢測(cè)LPL，PPARγ2的蛋白含量;于成軟骨誘導(dǎo)14天后，行番素紅染色，并Western-blot檢測(cè)COLⅡ，COLⅩ，SOX9的蛋白含量。
　　3.壓應(yīng)力對(duì)

3、骨不連細(xì)胞成軟骨分化影響的研究和分子機(jī)制探討
　　收集第三代到第五代細(xì)胞，分別給予10KPa，30KPa，50KPa，70KPa壓應(yīng)力刺激，應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。于加壓14天后細(xì)胞行Q-PCR檢測(cè)ColⅡ、ColⅩ、SOX9、TGFβ1的mRNA的含量。采用慢病毒載體介導(dǎo)con-shRNA及TGFβ1-shRNA感染NCs細(xì)胞，于96h后行GFP免疫熒光檢測(cè)陽(yáng)性率，并Western-blot檢測(cè)TGFβ1表達(dá)量。對(duì)感染c

4、on-shRNA及TGFβ1-shRNANCs的NCs細(xì)胞分成三組，一組為感染con-shRNA未加壓組，一組為感染TGFβ1-shRNA未加壓組，剩余一組為感染TGFβ1-shRNA加壓組。于培養(yǎng)后7天收集細(xì)胞行P-smad2，Smad2，TGFβ1，ColⅡ、ColⅩ、SOX9蛋白量的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)組織塊培養(yǎng)法結(jié)合傳代所得到的細(xì)胞形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形，接近融合狀態(tài)時(shí)可呈現(xiàn)旋渦樣生長(zhǎng)，傳第10代細(xì)胞的增殖能力

5、減弱，出現(xiàn)寬大梭形，排列紊亂。90％以上的細(xì)胞表達(dá)CD29和CD44;小于8.5％的細(xì)胞表面表達(dá)CD34，CD45。經(jīng)MTT方法檢測(cè)，第5代細(xì)胞增殖能力最佳。
　　2.骨不連細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始逐漸發(fā)生改變，局部變成多角形，寬大梭形，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，最后成集落層疊生長(zhǎng)，于誘導(dǎo)7天時(shí)Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性，誘導(dǎo)21天茜素紅染色陽(yáng)性，Western-Blot結(jié)果顯示，高表達(dá)ALP，OC及BSP;經(jīng)成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)

6、梭形逐漸變?yōu)閳A形，短梭形，正方形，不規(guī)則形狀，呈現(xiàn)“放射狀觸須”樣改變，最后可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)透亮的脂滴形成。于誘導(dǎo)14天油紅O染色陽(yáng)性，Western-Blot結(jié)果顯示，高表達(dá)LPL及PPAR-γ2;經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)逐漸變成圓形，橢圓形及多邊形。誘導(dǎo)14天番素紅染色陽(yáng)性，Western-Blot結(jié)果顯示，高表達(dá)ColⅡ,ColⅩ和SOX9。
　　3.骨不連細(xì)胞給予加壓后細(xì)胞形態(tài)逐漸增大，成寬大形狀，細(xì)胞分泌物增多，細(xì)胞質(zhì)變得模糊。

7、經(jīng)MTT檢查，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。通過(guò)對(duì)骨不連干細(xì)胞的加壓刺激作用，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞分化標(biāo)志因子ColⅡ、ColⅩ、SOX9，TGFβ1的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，并隨著壓力增大而上升。采用慢病毒載體介導(dǎo)TGFβ1-shRNA感染NCs細(xì)胞，通過(guò)GFP熒光檢測(cè)顯示，NCs細(xì)胞的慢病毒感染率達(dá)80％以上。Westernblot檢測(cè)TGFβ1表達(dá)效率。結(jié)果顯示，與對(duì)照組(Con-shRNA)對(duì)比，TGFβ1表達(dá)顯著抑制，證明慢病毒載體TGFβ1-sh

8、RNA能顯著下調(diào)細(xì)胞中TGFβ1的表達(dá)。用TGFβ1-shRNA聯(lián)合壓應(yīng)力處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)壓應(yīng)力和TGFβ1-shRNA聯(lián)合處理細(xì)胞后，壓應(yīng)力回復(fù)TGFβ1-shRNA對(duì)P-Smad2表達(dá)的抑制作用。同樣回復(fù)TGFβ1-shRNA對(duì)成軟骨細(xì)胞標(biāo)志因子ColⅡ，ColⅩ，SOX9蛋白的抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1.骨不連細(xì)胞NCs屬于一種間充質(zhì)干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的表型及有多向分化能力。
　　2.骨不連細(xì)胞NCs經(jīng)間接壓應(yīng)