南葶藶子抗腫瘤活性及HMGR基因初步研究.pdf

1、作為傳統(tǒng)中藥材，南葶藶子具有瀉肺平喘、行水消腫之功效。廣泛應用于心血管、痰多咳喘、高血脂、尿道系統(tǒng)結(jié)石、損傷和創(chuàng)傷及急性咽炎等疾病的預防和治療，效果顯著?，F(xiàn)代藥理學研究證明，南葶藶子具有廣泛的生物活性，如擴張血管、降低血脂、止咳平喘、促進傷口愈合等等。抗腫瘤實驗表明，葶藶子在很低劑量時，即可對子宮頸癌細胞株發(fā)揮很高的抑制活性；通過小鼠體內(nèi)實驗表明葶藶子對腹水癌有抑制作用。但有關(guān)南葶藶子在抑制人大肺癌細胞（NCI-H460）、乳腺癌細胞（

2、SF-268）和胃癌細胞（SGC-7901）等方面未見報道。
　　本實驗分為兩個部分：一、抗腫瘤活性的測定：南葶藶子的干燥粉末，經(jīng)70％乙醇回流提取，提取物減壓蒸餾后加水溶解，用石油醚和正丁醇依次萃取。分別得到乙醇提取物、石油醚提取物、正丁醇提取物。經(jīng)水蒸汽蒸餾得到揮發(fā)油。其中對正丁醇提取物做進一步分離。通過MTT比色法測定以上各組分對NCI-H460、SF-268和SGC-7901腫瘤細胞體外生長的影響。二、南葶藶子3-羥基-3

3、-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因研究：實驗表明南葶藶子及全草含較高的萜類物質(zhì)（種子：14.727％；全草：22.89％）。植物體內(nèi)萜類物質(zhì)的合成與HMGR緊密相關(guān)。HMGR催化HMG-CoA向MVA轉(zhuǎn)化，該酶是萜類物質(zhì)合成的第一個關(guān)鍵酶，因而有著極高的研究價值。本實驗借助RACE技術(shù)，對HMGR基因進行初步研究。實驗結(jié)果如下：
　　1．選用NCI-H460、SF-268和SGC-7901等3種腫瘤細胞，通過MTT比色法測定

4、南葶藶子的乙醇、石油醚、正丁醇提取物和揮發(fā)油的抗腫瘤活性。濃度為100μg/mL時，乙醇提取物對NCI-H460腫瘤細胞抑制活性最強，達到78.10％；正丁醇提取物和揮發(fā)油對SF-268腫瘤細胞抑制活性最為明顯，分別為76.27％和61.25％。
　　2．南葶藶子的不同提取物對3種腫瘤細胞的抑制作用均表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。依據(jù)回歸方程計算出各提取物對NCI-H460、SF-268和SGC-7901腫瘤細胞的的半數(shù)抑制濃度IC50，依

5、次為乙醇提取物21.52和362.74μg/mL，SF-268細胞的IC50未測定；正丁醇提取物93.41μg/mL、23.21μg/mL和144.5μg/mL；揮發(fā)油98.23μg/mL、59.58μg/mL和119.31μg/mL。
　　3．南葶藶子的脂肪油和揮發(fā)油在化學成分組成、主成分含量和抗腫瘤活性方面有很大差異。揮發(fā)油中未發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸和甾醇類物質(zhì)，脂肪油中未見有萜類和烷烴類成分。脂肪油的抗腫瘤活性要明顯弱于揮發(fā)油。<

6、br>　　4．從南葶藶子中分離出7種化合物，鑒定出其中的3種，分別為β-谷甾醇、胡蘿卜苷、芥子酸甲酯。抗腫瘤實驗表明這些物質(zhì)活性較低。未能找出正丁醇組分中抗腫瘤活性較高的化學物質(zhì)，該實驗有待進一步深入研究。
　　5．根據(jù)簡并引物擴增出播娘蒿HMGR基因458bp的保守區(qū)序列，該片段核苷酸序列與擬南芥、蘿卜、桑cDNA相似性分別為91％、89％和80％；其氨基酸序列與擬南芥、蘿卜、印度胡黃連、杜仲、橡膠樹、陸地棉等相似性分別為98％

7、、96％、89％、88％、88％和87％。
　　6．通過3’RACE擴增得到一段785bp的核苷酸序列，經(jīng)與保守區(qū)片段進行拼接，得到的片段為892bp。根據(jù)檢索到的開放閱讀框(ORF)核苷酸序列推導出播娘蒿HMGR基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，共233個氨基酸殘基。分子量為23990.0（Da），等電點（PI）為5.88。
　　7．經(jīng)BLASTN分析發(fā)現(xiàn)，播娘蒿HMGR基因與擬南芥HMGR基因家族有高度的同源性。核苷酸序列與