柚皮素滴眼液對光感受器細(xì)胞凋亡的防治作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　柚皮素是一種具有多種眼科藥理作用的黃酮類化合物，前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)1％柚皮素滴眼液對N-甲基-N-亞硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)誘導(dǎo)的大鼠光感受器細(xì)胞凋亡具有防治作用。因此，本課題進行1％柚皮素滴眼液眼部藥代動力學(xué)研究，并進一步明確柚皮素滴眼液對MNU誘導(dǎo)大鼠光感受器細(xì)胞凋亡的防治作用，體外實驗以光損傷和H2O2誘導(dǎo)的小鼠視錐細(xì)胞(661W細(xì)胞株)損傷模型為研究對象，探討柚皮素對光感受器細(xì)

2、胞凋亡的作用機制。
　　方法:
　　(1)柚皮素滴眼液眼部藥代動力學(xué)研究:新西蘭兔滴眼給予1％柚皮素滴眼液，每眼1滴(50μL)，在給藥后的相應(yīng)時間點采血，處死動物，摘眼球，分離眼球組織，采用LC-MS/MS方法測定角膜、房水、玻璃體、視網(wǎng)膜以及血漿中柚皮素的濃度。
　　(2)柚皮素滴眼液對MNU誘導(dǎo)的光感受器細(xì)胞凋亡的防治作用研究:單劑量腹腔注射MNU建立大鼠光感受器細(xì)胞凋亡模型，大鼠雙眼在造模前7天至造模后17天分

3、別滴眼給予溶劑滴眼液、0.5％和1％柚皮素滴眼液，一天三次，每次每眼一滴。通過視覺電生理儀檢查視網(wǎng)膜功能、水迷宮行為學(xué)試驗以及HE染色組織病理學(xué)檢查綜合評價柚皮素滴眼液對MNU誘導(dǎo)的大鼠光感受器細(xì)胞凋亡的作用。
　　(3)柚皮素對光誘導(dǎo)的661W細(xì)胞凋亡的防治作用機制研究:體外培養(yǎng)661W細(xì)胞株，通過光照8h建立661W細(xì)胞光損傷模型，造模后即刻加入0.5-100 mg/L柚皮素溶液孵育24 h。通過MTT法檢測細(xì)胞活性，流式細(xì)胞

4、術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS濃度。
　　(4)柚皮素對H2O2誘導(dǎo)的661W細(xì)胞氧化損傷的防治作用機制研究:體外培養(yǎng)661W細(xì)胞株，新鮮配制的5μmol/L H2O2與細(xì)胞孵育4h，換液，加入0.5-100 mg/L柚皮素溶液孵育24 h。通過MTT法檢測細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS濃度。
　　結(jié)果:
　　(1)柚皮素滴眼液眼部藥代動力學(xué)研究:建立了測定柚皮素的LC-M

5、S/MS方法，其方法學(xué)驗證表明方法的靈敏度、專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性以及回收率符合生物樣品分析方法驗證的要求，適合用于柚皮素滴眼液的眼部藥代動力學(xué)研究。參數(shù)AUC(0-t)顯示，在角膜上柚皮素的暴露量最大，房水、視網(wǎng)膜以及玻璃體次之;柚皮素在角膜、房水、玻璃體、視網(wǎng)膜的Cmax分別在給藥后的0.083、0.75、0.083和0.083h達(dá)到67945.30±4109.34 ng/g、1325.69±239.34 ng/mL、160.

6、52±38.78 ng/mL和1927.08±660.77 ng/g;各眼部組織的半衰期分別為9.37、0.65、1.17和4.62 h。在Cmax和Tmax兩個參數(shù)上可以看出血漿中總柚皮素與游離柚皮素濃度比較無統(tǒng)計學(xué)差異，總柚皮素的Cmax在給藥后0.083 h達(dá)到35.12±0.54 ng/mL。
　　(2)柚皮素滴眼液對MNU誘導(dǎo)的光感受器細(xì)胞凋亡的防治作用研究:視覺電生理儀檢測閃光視網(wǎng)膜電圖(FERG)和視網(wǎng)膜振蕩電位(O

7、Ps)結(jié)果顯示溶劑對照組大鼠的振幅顯著下降，潛伏期顯著延長。與溶劑對照組比較，0.5％和1％柚皮素滴眼液顯著逆轉(zhuǎn)MNU模型大鼠的振幅下降和潛伏期的延長。行為學(xué)水迷宮試驗結(jié)果顯示:與溶劑對照組比較，0.5％和1％柚皮素滴眼液都能增加穿越次數(shù)(P＜0.05)。視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示柚皮素滴眼液能劑量依賴性地保護大鼠視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)。
　　(3)柚皮素對光誘導(dǎo)的661W細(xì)胞凋亡的防治作用機制研究:MTT法檢測結(jié)果顯示100 mg/L柚皮素

8、對正常培養(yǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞增殖無影響，溶劑對照組細(xì)胞存活率顯著降低，而1-100 mg/L柚皮素有促進光損傷細(xì)胞存活的作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示溶劑對照組細(xì)胞的凋亡細(xì)胞顯著增加，10 mg/L柚皮素有抑制光損傷細(xì)胞凋亡的作用。熒光探針H2DCFDA檢測結(jié)果顯示，溶劑對照組細(xì)胞內(nèi)ROS顯著增加，10 mg/L柚皮素具有逆轉(zhuǎn)作用。
　　(4)柚皮素對H2O2誘導(dǎo)的661W細(xì)胞氧化損傷的防治作用機制研究:MTT法檢測結(jié)果顯示溶劑對照組細(xì)胞

9、的存活率顯著降低，而5-100 mg/L柚皮素干預(yù)后，661W氧化損傷細(xì)胞的活性明顯增強。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示溶劑對照組細(xì)胞的凋亡細(xì)胞顯著增加，10 mg/L柚皮素有抑制氧化損傷細(xì)胞凋亡的作用。熒光探針H2DCFDA檢測結(jié)果顯示，溶劑對照組細(xì)胞內(nèi)ROS顯著增加，10 mg/L柚皮素具有逆轉(zhuǎn)作用。
　　結(jié)論:
　　(1)1％柚皮素滴眼液滴眼給藥后，柚皮素在新西蘭兔視網(wǎng)膜中能夠達(dá)到有效的治療濃度，表明柚皮素滴眼給藥有望成為治療