液質(zhì)聯(lián)用技術在藥物降解產(chǎn)物及雜質(zhì)分析中的應用.pdf

1、藥物的質(zhì)量與人類健康密切相關，藥物中降解產(chǎn)物及微量雜質(zhì)的鑒定分析也受到越來越多的重視。藥物中雜質(zhì)的存在會降低藥物的活性，影響藥物的穩(wěn)定性，甚至產(chǎn)生副作用和不良反應，對人體健康產(chǎn)生危害，因此，對藥物中雜質(zhì)的控制是保證藥物質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。而對藥物降解產(chǎn)物進行研究，不僅可以預測藥物的穩(wěn)定性，指導藥物的生產(chǎn)過程并選擇合適的包裝和貯藏條件，而且有助于建立藥物的降解途徑并對所建分析方法的可行性進行驗證。
　　拉科酰胺是一種新型的抗癲癇藥，常作

2、為輔助藥物用于治療成年患者的癲癇部分性發(fā)作，但有關拉科酰胺中雜質(zhì)及降解產(chǎn)物的研究僅有1篇報道，仍有降解產(chǎn)物未被鑒定。氨芐西林鈉屬于半合成的β-內(nèi)酰胺類抗生素，主要用于抗感染的治療，前期研究發(fā)現(xiàn)氨芐西林鈉一些降解產(chǎn)物并不能根據(jù)已有雜質(zhì)對照品或相關文獻數(shù)據(jù)進行鑒定。因此，為更好地控制這些藥物的質(zhì)量，須建立有效的分析方法對其降解產(chǎn)物及未知雜質(zhì)進行快速定性分析。
　　高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術集液相色譜的高分離能力與質(zhì)譜

3、的強結構解析能力于一體，已成為藥物雜質(zhì)分析的有力工具。本研究分別以拉科酰胺和氨芐西林鈉為研究對象，以HPLC-MS技術為分析手段，對拉科酰胺和氨芐西林鈉多種降解條件下的降解產(chǎn)物以及雜質(zhì)進行了結構解析和推斷，并分析了其降解特征，期望為其質(zhì)量控制提供新的信息，也為藥物雜質(zhì)的研究提供新的手段。
　　第一部分拉科酰胺降解產(chǎn)物的HPLC-MS/MS分析
　　目的:采用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)離子阱質(zhì)譜（HPLC-QTrap-MS）

4、和高效液相色譜串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜(HPLC-IT-TOF-MS)技術對拉科酰胺樣品在酸、堿和氧化降解條件下的降解特征進行研究，并對其降解產(chǎn)物進行結構解析和推斷。
　　方法:將拉科酰胺樣品分別在酸（1 mol/L鹽酸）、堿（1 mol/L氫氧化鈉）和氧化(30％ H2O2)條件下進行強降解，采用HPLC-QTrap-MS技術對其降解產(chǎn)物進行分析，根據(jù)一級和二級質(zhì)譜信息對未知降解產(chǎn)物的分子量和可能分子結構進行推斷;然后采用HPLC

5、-IT-TOF-MS技術對各降解樣品進行分析，獲得降解產(chǎn)物及其碎片離子的準確分子質(zhì)量數(shù)和可能分子組成，進一步驗證推斷結果。實驗采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(150mm×4.6 mm，5μm)進行分離，梯度洗脫，流動相為乙腈-2mmol/L乙酸銨（含0.1％甲酸），流速為0.8 mL/min。
　　結果:本實驗對拉科酰胺所有降解樣品中的7個降解產(chǎn)物進行了分析，推斷出其中4個降解產(chǎn)物的結構，并對其余降解產(chǎn)物進行

6、了部分定性分析;4個降解產(chǎn)物分別鑒定為:(R)-2-氨基-N-苯基-3-甲氧基丙酰胺(m/z209)，2-乙?；?N-芐基丙烯酰胺(m/z219)，2-乙酰胺基-N-苯甲醇基-3-甲氧基丙酰胺(m/z267)和2-乙酰氨基-N-苯基-3-羥基丙酰胺(m/z237)。
　　結論:1本實驗所用方法靈敏、有效，能夠?qū)⒗契０放c其降解產(chǎn)物完全分離;在所用質(zhì)譜條件下可獲得豐富、準確的質(zhì)譜信息，從而快速對降解產(chǎn)物進行定性分析。2拉科酰胺在酸、

7、堿和氧化條件下均可發(fā)生不同程度的降解，其中化合物(R)-2-氨基-N-苯基-3-甲氧基丙酰胺（m/z209）為其主要降解產(chǎn)物。3化合物2-乙?；?N-芐基丙烯酰胺(m/z219)，2-乙酰胺基-N-苯甲醇基-3-甲氧基丙酰胺(m/z267)和2-乙酰氨基-N-苯基-3-羥基丙酰胺(m/z237)為首次報道。
　　第二部分氨芐西林鈉降解產(chǎn)物的HPLC-MS/MS分析
　　目的:采用HPLC-QTrap-MS技術和HPLC-Q-

8、TOF-MS（液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜）技術對氨芐西林鈉樣品在各種強降解條件下的降解特征進行研究，并對其降解產(chǎn)物進行結構解析和推斷。
　　方法:將氨芐西林鈉樣品分別在酸、堿、加熱、光照和高濕條件下進行降解，聯(lián)合應用HPLC-QTrap-MS技術的EMS-ER-IDA-EPI（增強全掃描-增強分辨率掃描-信息依賴-增強型子離子掃描）、PREC-ER-IDA-EPI(母離子掃描-增強分辨率掃描-信息依賴-增強型子離子掃描)和EP

9、I（增強型子離子掃描）三種掃描模式對降解樣品中的未知降解產(chǎn)物進行分析，并根據(jù)獲得的質(zhì)譜信息對其結構進行推斷;通過HPLC-Q-TOF-MS技術獲得各降解產(chǎn)物及其碎片離子的準確分子質(zhì)量數(shù)和可能分子組成，進一步驗證推斷結果。實驗采用Agilent Zorbax SB-C18（150mm×4.6 mm，5μm）色譜柱進行分離，梯度洗脫，流動相為乙腈-1 mmol/L乙酸銨溶液（加0.1％乙酸），流速為0.8 mL/min。
　　結果:本

10、實驗對氨芐西林鈉樣品在各種降解條件下的19個雜質(zhì)和降解產(chǎn)物進行了鑒定和定性分析，其中有4個降解產(chǎn)物未曾報道，為新鑒定化合物，分別為:(Z)-2-氧-2-（（（2-氧-3-苯基-2，3，6，7-四氫-1H-1，4-二氮雜卓-5-基）亞甲基）氨基-1-苯乙銨（m/z349），(E)-2-((（2-（2-氨基-2-苯乙酰胺基）-2-苯乙?；﹣啺被然┘谆?5，5-二甲基四氫噻唑-4-羧酸(m/z499)，(E)-1-羰基-N-((3，

11、6-二氧-5-苯基-1，6-二氫二氮雜苯-2(3H)-取代基）甲基）-2-巰基-2-甲基丙烷-1-胺(m/z348)和5-苯甲氨基-7-甲酰基-2，2-二甲基-2，3-二氫咪唑并[5,1-b]噻唑-3-羧酸(m/z332)。
　　結論:1 HPLC-Q-TOF-MS方法靈敏度高、專屬性好、準確度高，在未知雜質(zhì)定性方面可獲得更為豐富的結構信息;本實驗所建方法能夠?qū)逼S西林鈉與其降解產(chǎn)物很好的分離，并可快速、有效地對其降解產(chǎn)物進行鑒定

12、和定性分析。2 HPLC-QTrap-MS中EMS-ER-IDA-EPI、PREC-ER-IDA-EPI和EPI模式的聯(lián)合應用可有效地對藥物中未知雜質(zhì)和降解產(chǎn)物進行定性分析。
　　第三部分氨芐西林鈉中雜質(zhì)的HPLC-MS/MS分析
　　目的:建立靈敏、有效的HPLC-QTrap-MS方法，對氨芐西林鈉樣品中的雜質(zhì)進行檢測和分析，并與國外市售氨芐西林鈉樣品進行比較。
　　方法:應用HPLC-QTrap-MS技術的增強全掃

13、描(EMS)模式分別對氨芐西林鈉及其國外市售樣品進行分析:1通過與系統(tǒng)適用性對照品（包含氨芐西林，氨芐西林噻唑酸，二酮哌嗪氨芐西林，氨芐西林開環(huán)二聚體，氨芐西林閉環(huán)二聚體和氨芐西林開環(huán)三聚體）中的已知雜質(zhì)進行色譜和質(zhì)譜信息的比較，從而對樣品中存在的這些雜質(zhì)進行鑒定和確認;2對于樣品中的未知雜質(zhì)，可依據(jù)一級質(zhì)譜圖中的[M+H]+，[M+Na]+和[M+K]+離子峰來判斷其分子量，再結合質(zhì)譜圖中的碎片離子信息對其進行結構解析和推斷，并對碎片

14、離子進行歸屬。實驗采用Kromasil C18(150 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱進行分離，梯度洗脫，流動相為甲醇-乙酸水溶液(pH3.4)，流速為0.8 mL/min。
　　結果:1系統(tǒng)適用性對照品中的雜質(zhì)氨芐西林噻唑酸、二酮哌嗪氨芐西林、氨芐西林開環(huán)二聚體和氨芐西林閉環(huán)二聚體在氨芐西林鈉及其國外市售樣品中均可被檢測到;雜質(zhì)氨芐西林開環(huán)三聚體僅在國外市售樣品中被檢測到。2根據(jù)色譜峰的質(zhì)譜信息推斷出系統(tǒng)適用性對照品中未包含