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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:研究GPR4(G protein-coupled receptor 4,GPR4)配體溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine,LPC)及鞘氨醇磷脂酰膽堿(sphingosylphosphorylcholine,SPC)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的生長(zhǎng)效應(yīng)及有關(guān)信號(hào)通路。 方法:采用脂質(zhì)體2000將裝有GPR4受體基因的p
2、EFneo真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HUVEC,并通過(guò)G418(800μg/ml)篩選獲得GPR4基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株;RT-PCR法鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后GPR4受體mRNA的表達(dá)情況;MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)活力;AO染色法觀察LPC及SPC對(duì)HUVEC細(xì)胞造成的形態(tài)改變; Western blot法檢測(cè)LPC及SPC與其受體相互作用后對(duì)caspase-3前體、p-JNK、p-Akt及MMP-2蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果:成功獲得了GPR
3、4基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株;隨著LPC(0.5,1,2,4,8μmol/l)及SPC(0.25,0.5,1.0μmol/l)濃度的增加, LPC使HUVEC細(xì)胞活力下降, 570nm OD值依次為:1.50±0.136;1.45±0.050;1.42±0.208;1.36±0.191;1.32±0.122;1.08±0.189。SPC使細(xì)胞活力依次增強(qiáng),570nm OD值依次為:1.08±0.089;1.15±0.097;1.21±0.096
4、;1.30±0.11。LPC對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷,隨著濃度的增加,有些細(xì)胞可見(jiàn)致密濃染的黃綠色,而SPC卻對(duì)細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有造成明顯的改變。LPC使caspase-3前體蛋白的表達(dá)先增加后減少,MMP-2蛋白的表達(dá)下調(diào),活化JNK激酶,使p-JNK蛋白的表達(dá)先增加后減少。SPC使p-Akt及MMP-2的表達(dá)先增加后減少,抑制caspase-3前體蛋白的表達(dá)。 結(jié)論: 1. LPC與受體GPR4作用后使HUVEC細(xì)胞活性下降,
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