敬釗纓毛蛛毒素分子多樣性和功能研究.pdf

1、敬釗纓毛蛛是在我國海南島發(fā)現(xiàn)的一種有毒蜘蛛。它的毒液由許多具有不同生物活性物質(zhì)組成。為了更好地開發(fā)利用該生物資源，闡明敬釗纓毛蛛毒素分子多樣性及其遺傳進化機制是非常重要的。我們?nèi)【瘁摾t毛蛛的毒腺建立cDNA文庫，隨機挑取單克隆進行測序，得到788個高質(zhì)量的表達序列標簽。這些表達序列標簽去冗余后，得到356個唯一序列，其中包括271個單拷貝序列和85個多拷貝重疊序列。這些唯一序列的31.4％是編碼分泌蛋白的，其中29.1％是富含半胱氨酸的

2、多肽，此類多肽稱之為胱氨酸結(jié)毒素（CKTs），以及2.3％的其他分泌蛋白序列；54.0％是與普通細胞蛋白相關的；還有14.6％的序列沒找到相似的已知序列。所有鑒定到的序列提交GenBank，序列接入號為：EU233831—EU233934和FE530957—FE531203。蜘蛛粗毒中的胱氨酸結(jié)毒素是作用于各種離子通道的新型配體。對104個胱氨酸結(jié)毒素前體進行系統(tǒng)進化分析顯示，這些毒素可以分為6個家族，以及19個低相似性序列構(gòu)成的“孤兒

3、”家族。為了進一步研究這些毒素家族的結(jié)構(gòu)、功能和進化關系，我們分離純化到10個分別來自各家族的毒素，對其進行電生理功能檢測、結(jié)構(gòu)建模比較、進化分析和豐度分析。實驗結(jié)果顯示這些毒素家族分屬兩種類型：孔道堵塞毒素和門控調(diào)制毒素。孔道堵塞毒素在粗毒中的含量比較多，在蜘蛛中分布較廣?？椎蓝氯亩舅刈饔冒悬c專一，而所作用的靶點在生物進化中也較保守。因此，這類毒素是進化中比較保守、產(chǎn)生比較早的一類。門控調(diào)制毒素所包含的分子種類很多，這是與通道多樣化

4、的調(diào)制位點共進化的結(jié)果。對這些多肽毒素系統(tǒng)研究有可能為深入的藥理學應用和研究提供大量的分子模板。另一方面，對普通細胞蛋白相關的轉(zhuǎn)錄子進行的基因注釋揭示了一些新的可能的毒素成分和毒囊重要細胞生理過程的相關成分，比如蛋白翻譯后修飾，細胞運動，蛋白質(zhì)合成，能量供應等等。敬釗纓毛蛛毒腺的轉(zhuǎn)錄組分析和基因的注釋編目展示了毒腺這個特化的產(chǎn)毒器官中的生理概況。 敬釗毒素—Ⅲ（JZTX—Ⅲ）是來自于敬釗纓毛蛛的一個通過電壓門控調(diào)制來抑制心肌鈉通

5、道的毒素。與β—蝎毒素不同的是，它使通道激活電壓朝去極化方向漂移約10mV，推測其結(jié)合位點可能為位點4。JZTX—Ⅲ展示了其對電壓門控心肌鈉通道亞型高親和力和高選擇性，使之有希望成為研究心肌鈉通道的有力工具。然而，該分子與鈉離子通道作用的活性表面還不得而知。為此，本課題中我們成功表達了JZTX—Ⅲ，表達的毒素與天然的毒素在分子、構(gòu)型和生理學活性上都一致。于是，對其進行丙氨酸掃描，繼續(xù)表達JZTX—Ⅲ的20個單殘基由丙氨酸取代的突變體。其

6、中一個突變體未能表達成功。用膜片鉗實驗——突變體在表達于HEK293細胞上的Nav1.5對電流的作用。實驗表明，13個突變體對抑制Nav1.5電流的濃度依賴性的改變很小，有6個突變體對此影響較大，有一個甚至無法檢測到活性。突變體實驗證明其活性表面是由疏水氨基酸和酸性氨基酸組成，而堿性氨基酸的突變對毒素抑制Nav1.5通道電流的活性影響不大。而且，當13位的精氨酸突變?yōu)楣劝彼釙r，其抑制Nav1.5的IC50值為31.9nM，其活性是野生型

7、JZTX—Ⅲ的十倍。在JZTX—Ⅲ的三維結(jié)構(gòu)圖上描出這些關鍵殘基，疏水性殘基在一個面上形成一個疏水面，兩個酸性殘基處于N端，在疏水面的相對面。從以上結(jié)果確定了JZTX—Ⅲ這個門控調(diào)制毒素專一作用于Nav1.5的分子活性表面，提示JZTX—Ⅲ在與心肌鈉通道結(jié)合時采取的是一種被稱為Voltage Sensor Trapping的模式，利用其疏水面結(jié)合于心肌鈉通道DomainⅡ區(qū)域，而其另一面的帶電荷殘基，特別是Asp1和Glu3利用電性引力