虎紋捕鳥蛛毒素-Ⅳ突變體K27A的化學(xué)合成與性質(zhì)以及兩種海南敬釗纓毛蛛毒素的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成的方法在Pioneer固相多肽合成儀上合成了用丙氨酸代替虎紋捕鳥蛛毒素-Ⅳ的第27位的賴氨酸的突變體K27A-HWTX-Ⅳ,通過反相HPLC對不同條件下突變體的氧化復(fù)性結(jié)果進(jìn)行監(jiān)測,摸索出其最佳氧化復(fù)性條件為:0.1mol/LTris-HCl,pH8.0,GSH 1mmol/L,GSSG0.1mmol/L的復(fù)性緩沖液,樣品濃度為0.1mg/mL.復(fù)性產(chǎn)物經(jīng)HPLC純化并用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜法

2、進(jìn)行鑒定,相對分子質(zhì)量為4050.63Da.小鼠離體膈神經(jīng)-膈肌標(biāo)本測活實(shí)驗(yàn)表明:復(fù)性后的突變體生物學(xué)活性比天然HWTX-Ⅳ降低86﹪,表明第27位的賴氨酸為虎紋捕鳥蛛毒素-Ⅳ活性相關(guān)的殘基.從中國海南敬釗纓毛蛛(Chilobrachys jingzhao)粗毒中,結(jié)合陽離子交換和反相高效液相色譜分離得到兩種多肽神經(jīng)毒素,分別命名為海南敬釗纓毛蛛毒素-Ⅴ(jingzhaotoxin-Ⅴ,JZTX-Ⅴ)和海南敬釗纓毛蛛毒素-Ⅳ(jingz

3、haotoxin-Ⅳ,JZTX-Ⅳ).經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜分析,相對分子質(zhì)量分別為3951.69 Da和3601.47 Da.利用Edman降解氣相蛋白質(zhì)測序儀測得海南敬釗纓毛蛛毒素-Ⅴ的一級結(jié)構(gòu)NH<,2>-ECTKLLGGCTKDSECCPHLGCRKKWPYHCGWDGTF-CONH<,2>,六個(gè)Cys形成三對二硫鍵.10μg/mL的該毒素完全阻斷小鼠膈神經(jīng)-膈肌神經(jīng)肌肉接頭傳遞的時(shí)間為30±0.6min.小白鼠腦室注射能產(chǎn)生

4、神經(jīng)性興奮,高劑量可使小鼠致死.同源性搜索表明該毒素與蜘蛛Grammostola spatulata中ω-Grammotoxin SIA和HaTx毒素和蜘蛛Scodra griseipes中的SGTx1毒素有很高的同源性.利用Edman降解氣相蛋白質(zhì)測序儀測得海南敬釗纓毛蛛毒素-Ⅳ一級結(jié)構(gòu)為NH<,2>-GCGGLMAGCDGKSTFCCSGYNCSPTWKWCVYARP-CONH<,2>,六個(gè)Cys形成三對二硫鍵.同源性搜索表明該毒素

5、與蜘蛛Chinese bird spider Ornithoctonus huwena中的SHL-Ⅰ、Chinese birdspider Ornithoctonus hainana中的HNTX-Ⅲ和Mexican red kneetarantula(Brachypelma smithii)中的TXP 5有較高的同源性.生物學(xué)活性研究表明JZTX-Ⅳ不具備以上毒素已知的生物學(xué)功能,但能部分阻斷表達(dá)于爪蟾卵母細(xì)胞上的外向延遲整流Kv1.2