敬釗纓毛蜘蛛毒素-V對(duì)LTP和認(rèn)知行為改善作用的分子機(jī)制研究.pdf

1、LTP自發(fā)現(xiàn)以來即被公認(rèn)為學(xué)習(xí)記憶的分子模型，藥物成癮實(shí)則為一種異常的學(xué)習(xí)記憶，病理性學(xué)習(xí)記憶過程。在前期的試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)JZTX-Ⅴ對(duì)戒毒具有明顯作用，鑒于LTP與學(xué)習(xí)記憶之間千絲萬縷的聯(lián)系，近年來，我們開展了系列JZTX-Ⅴ對(duì)LTP和認(rèn)知行為作用及其分子作用機(jī)制的研究。本研究分為四個(gè)部分:
　　第一部分 JZTX-Ⅴ對(duì)大鼠海馬齒狀回LTP的影響
　　目的: 研究JZTX-Ⅴ對(duì)大鼠海馬齒狀回LTP的影響
　　方法:

2、 大鼠采用烏拉坦麻醉，待其深度麻醉后，將頭部固定在腦立體定位儀上，參照大鼠腦立體定位圖譜確定側(cè)腦室、DG及PP區(qū)位置，用顱鉆按照上述位置在大鼠腦上打孔，分別用來放置給藥導(dǎo)管、記錄電極R和刺激電極S。以刺激間隔0.033 Hz的刺激方波記錄基礎(chǔ)刺激。基礎(chǔ)刺激波形穩(wěn)定30 min后，給予高頻刺激誘導(dǎo)LTP形成，并研究10nM和100 nM JZTX-Ⅴ對(duì)LTP不同時(shí)期的作用
　　結(jié)果: 10nM和100 nM的JZTX-Ⅴ對(duì)LTP的基

3、礎(chǔ)傳遞期與空白組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是對(duì)LTP的誘導(dǎo)期與空白組相比都有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)
　　結(jié)論: JZTX-Ⅴ對(duì)海馬DG區(qū)突觸傳遞有顯著的增強(qiáng)作用
　　第二部分 JZTX-Ⅴ對(duì)Aβ和東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用研究
　　目的: 研究JZTX-Ⅴ對(duì)Aβ和東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用
　　方法: Aβ模型組:小鼠分為4組（對(duì)照組、Aβ模型組、JZTX-Ⅴ給藥組、陽性藥多奈哌齊組），

4、模型組、JZTX-Ⅴ給藥組和陽性藥物組連續(xù)3天通過側(cè)腦室給予Aβ1-42400 pmol/5μl進(jìn)行造模，其余組別正常給藥;東莨菪堿模型組:小鼠分為5組(對(duì)照組、東莨菪堿模型組、陽性藥多奈哌齊組、JZTX-Ⅴ給藥組(0.024μm和0.0024μm)，模型各組小鼠水迷宮試驗(yàn)訓(xùn)練前20分鐘腹腔注射東莨菪堿0.5mg/kg，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。手術(shù)恢復(fù)7天后，第八天開始給藥。陽性藥組每天灌胃給予5 mg/kg多奈哌齊，其余各組給予同劑

5、量的雙蒸水。JZTX-Ⅴ組側(cè)腦室給予JZTX-Ⅴ，其余各組側(cè)腦室給予等體積的鹽水。Morris水迷宮試驗(yàn)?zāi)┐谓o藥7天后進(jìn)行。
　　結(jié)果: Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:不論是Aβ1-42模型組還是東莨菪堿模型組在定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)指標(biāo)與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01），小鼠表現(xiàn)出明顯的空間學(xué)習(xí)記憶障礙。定位航行實(shí)驗(yàn)中，鹽酸多奈哌齊組的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與模型組相比明顯縮短(P＜0.05); JZTX-Ⅴ的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與模

6、型組相比明顯縮短(P＜0.05)。
　　空間探索實(shí)驗(yàn)中:與空白組相比，Aβ1-42和東莨菪堿模型組小鼠在原平臺(tái)所在象限的游程、時(shí)間比率、路程比率明顯減少。不論是陽性藥物組還是JZTX-Ⅴ組在原平臺(tái)所在象限的游程、路程比率與模型組比明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論: JZTX-Ⅴ對(duì)Aβ和東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有改善作用
　　第三部分 JZTX-Ⅴ對(duì)海馬CA1區(qū)瞬時(shí)外向鉀電流和延遲整流鉀電流的作用研究
　

7、　目的: 采用紅外腦片膜片鉗全細(xì)胞記錄方法，利用急性腦片，觀察JZTX-Ⅴ對(duì)小鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元A型鉀電流變化的影響，以探索JZTX-Ⅴ對(duì)LTP和認(rèn)知行為改善作用的分子機(jī)制。
　　方法: 選取出生兩周左右的KM小鼠制備海馬腦片，通過紅外腦片膜片鉗全細(xì)胞記錄，負(fù)壓破膜建立全細(xì)胞電壓鉗模式，鉗制細(xì)胞膜電位在-60 mV，在維持上述電壓的基礎(chǔ)上給予去極化電刺激，可誘使離子通道開放記錄電流，玻璃電極的電阻2-8 MΩ。腦片置于持續(xù)灌流

8、的通以混合氧的ACSF液中，通過重力灌流系統(tǒng)給予急性工具藥及測(cè)試藥物，通過EPC-10膜片鉗系統(tǒng)記錄JZTX-Ⅴ對(duì)小鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元瞬時(shí)外向鉀電流和延遲整流鉀電流及其激活、失活等特性的變化。
　　結(jié)果: 500 nM和1 uM JZTX-Ⅴ對(duì)小鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元全細(xì)胞A型鉀電流與空白組比較均有抑制作用，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而1 uM JZTX-Ⅴ對(duì)海馬的延遲整流鉀電流與空白組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;1 uM JZTX-Ⅴ與空白組

9、比較能使小鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元全細(xì)胞A型鉀電流的激活及失活曲線向去極化方向漂移不同的程度，改變了A型鉀通道的動(dòng)力學(xué)特征，但對(duì)延遲整流鉀通道的激活曲線沒有影響。
　　結(jié)論: 1 uM的JZTX-Ⅴ對(duì)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元IA電流大小有抑制作用，使IA通道的激活及失活曲線都向去極化方向移動(dòng)，我們推測(cè)JZTX-Ⅴ對(duì)海馬LTP的促進(jìn)作用有可能與其對(duì)A型鉀電流的調(diào)控有關(guān)。
　　第四部分 JZTX-Ⅴ對(duì)大鼠腦中Kv4.2及KChIP2

10、表達(dá)和內(nèi)化遷移的作用研究
　　目的: 研究JZTX-Ⅴ對(duì)Kv4.2及其相互作用蛋白KChIP2表達(dá)及內(nèi)化遷移的影響，以探索JZTX-Ⅴ對(duì)LTP和認(rèn)知行為改善作用的分子機(jī)制。
　　方法: 采用梯度離心方法分離細(xì)胞膜和內(nèi)涵體，研究JZTX-Ⅴ對(duì)Kv4.2及其相互作用蛋白KChIP2表達(dá)及內(nèi)化遷移的影響。以Na/K-ATPase作為細(xì)胞膜的標(biāo)志蛋白，采用EEA1標(biāo)志內(nèi)涵體。大鼠連續(xù)10天側(cè)腦室置管給予100 nM JZTX-Ⅴ，給

11、藥結(jié)束后斷頭取腦，分離海馬及皮層。通過Western Blot技術(shù)，研究JZTX-Ⅴ對(duì)Kv4.2及其相互作用蛋白KChIP2表達(dá)及內(nèi)化遷移的影響。
　　結(jié)果: 大鼠連續(xù)10天給予100nM JZTX-Ⅴ后，Kv4.2在皮層各部分如H1、P1、P2、S2中與空白對(duì)照組相比都沒有明顯變化(P＞0.05，n=3); KChIP2在皮層各部分如H1、P2、S2中與空白對(duì)照組相比都沒有明顯變化(P＞0.05，n=3)，但在P1組分中與空白對(duì)

12、照組相比明顯增加(P＜0.01，n=3); Kv4.2在海馬各部分如H1、P1、P2、S2中與空白對(duì)照組相比都沒有明顯變化(P＞0.05，n=3);KChIP2在海馬各部分如H1、P1、P2、S2中與空白對(duì)照組相比也都沒有明顯變化(P＞0.05，n=3)。
　　結(jié)論: 海馬結(jié)構(gòu)中顯示JZTX-Ⅴ對(duì)Kv4.2及KChIP2表達(dá)及內(nèi)化遷移與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;皮層中JZTX-Ⅴ對(duì)Kv4.2表達(dá)及內(nèi)化遷移與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與