枸杞籽油對(duì)慢性應(yīng)激小鼠抑郁樣行為和認(rèn)知障礙的改善作用與機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究采用小鼠慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型（Chronic unpredictable stress,CUS）,研究枸杞籽油（Lycium barbarumseed oil,LBSO）對(duì)慢性應(yīng)激引起的抑郁樣行為（Depression-like behavior）和認(rèn)知能力障礙（Cognitive deficits）的影響；并以中樞海馬（Hippocampus）為研究對(duì)象，以期揭示LBSO的應(yīng)激保護(hù)作用是否涉及抑制海馬神經(jīng)元的損

2、傷及BDNF信號(hào)通路的調(diào)制。
　　方法：
　　采用小鼠慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型(Chronic unpredictablestress,CUS)。雄性ICR小鼠90只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、陽(yáng)性藥物組(氟西汀,Fluoxetine,20mg/kg）、枸杞籽油低、中、高（2.5ml/kg，5ml/kg，10ml/kg）劑量組，每組15只，藥物干預(yù)時(shí)間35天。除正常組群養(yǎng)于獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室外，其余5組小鼠獨(dú)籠飼養(yǎng)

3、，并接受28天慢性不可預(yù)知刺激造模，這些刺激包括夾尾1min、4℃冰水游泳刺激5min、噪音刺激10min、禁食禁水24h、束縛1h、足底電擊5min（30V，0.5Hz）、通宵照明、潮濕墊料。造模完成后所有小鼠依次接受曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（Open field test,OFT）、懸尾實(shí)驗(yàn)（Tail suspension test,TST）、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（Forced swim test,FST）、Morris水迷宮（Morris water m

4、aze,MWM）四種行為學(xué)檢驗(yàn)，共計(jì)7天。行為學(xué)檢驗(yàn)完成后用4％水合氯醛麻醉小鼠，待角膜反射消失后眶叢取血，經(jīng)離心后得血清用于Elisa法測(cè)定血清皮質(zhì)酮含量。小鼠經(jīng)取血后，分兩種方式取材。每組10只小鼠取血后處死，開(kāi)顱取海馬，液氮速凍后轉(zhuǎn)入超低溫冰箱凍存。小鼠海馬用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot,WB），每組剩余小鼠心臟依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，灌注完成后開(kāi)顱取全腦，石蠟包埋后切片。腦切片用于組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)（包括HE染色

5、和尼氏染色）和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)（Immunohistochemistry,IM）。
　　結(jié)果：
　　1.枸杞籽油對(duì)慢性應(yīng)激小鼠抑郁樣行為的影響：
　　a.在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（OFT）中。與正常組相比，模型組小鼠穿越的格數(shù)降低（p<0.01）；與模型組相比，氟西汀組和枸杞籽油高劑量組小鼠穿越的格數(shù)升高（p<0.01）。
　　b.在懸尾實(shí)驗(yàn)（TST）中。與正常組相比，模型組小鼠的不動(dòng)時(shí)間升高（p<0.05）；與模型組相比，除

6、枸杞籽油中劑量組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，各試驗(yàn)藥物組小鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著降低（p<0.01,p<0.05）。
　　c.在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST)中。與正常組相比，模型組小鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著升高（p<0.01）；與模型組相比，枸杞籽油低、中、高三個(gè)劑量組小鼠的不動(dòng)時(shí)間均顯著降低（p<0.01）。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：枸杞籽油可改善慢性應(yīng)激小鼠的抑郁樣行為。
　　2.枸杞籽油對(duì)慢性應(yīng)激小鼠認(rèn)知障礙的影響：
　　a.在Morr

7、is水迷宮（MWM）的空間記憶采集實(shí)驗(yàn)中。與正常組相比，模型組小鼠的逃逸潛伏期顯著升高（p<0.05）；與模型組相比，氟西汀組和枸杞籽油高劑量組小鼠的逃逸潛伏期顯著降低（p<0.01）。與正常組相比，模型組小鼠的平均潛伏距離顯著升高（p<0.05）；與模型組相比，除枸杞籽油中劑量組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，各試驗(yàn)藥物組小鼠的平均潛伏距離顯著降低（p<0.01,p<0.05）?？臻g記憶采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：枸杞籽油能緩解慢性應(yīng)激小鼠的學(xué)習(xí)能力下降。

8、
　　b.在Morris水迷宮（MWM）的空間探索實(shí)驗(yàn)中。與正常組相比，模型組小鼠的原平臺(tái)象限游程比率顯著降低（p<0.01）；與模型組相比，枸杞籽油高劑量組小鼠的原平臺(tái)象限游程比率顯著身高（p<0.05）。與正常組相比，模型組小鼠的原平臺(tái)象限時(shí)間比率顯著降低（p<0.01）。與模型組相比，各試驗(yàn)藥物組與模型組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組相比，模型組小鼠的原平臺(tái)有效穿越次數(shù)顯著降低（p<0.01）；與模型組相比，枸杞籽油高劑量組小

9、鼠的原平臺(tái)有效穿越次數(shù)顯著升高（p<0.01）。與正常組在第三象限極有目的性的探索軌跡相比，模型組小鼠在整個(gè)迷宮中的探索是無(wú)傾向性、無(wú)目的性的。與模型組無(wú)目的性的軌跡相比，除枸杞籽油中劑量組無(wú)明顯差異外，各試驗(yàn)藥物組小鼠的探索軌跡有較強(qiáng)的目的性?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：枸杞籽油可能緩解慢性應(yīng)激小鼠的記憶障礙。
　　3.枸杞籽油對(duì)慢性應(yīng)激小鼠血清皮質(zhì)酮的影響：
　　在Elisa測(cè)定小鼠血清皮質(zhì)酮的實(shí)驗(yàn)中。與正常組相比，模型組小鼠

10、的血清皮質(zhì)酮顯著升高（p<0.01）；與模型組相比，氟西汀組和枸杞籽油高劑量組小鼠的血清皮質(zhì)酮顯著降低（p<0.01、p<0.05）。Elisa結(jié)果表明：枸杞籽油可以改善慢性應(yīng)激小鼠的血清皮質(zhì)酮含量升高。
　　4.組織形態(tài)學(xué)結(jié)果：
　　a.HE染色結(jié)果：相比于正常組，模型組小鼠CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常組（p<0.05）與模型組相比，氟西汀和枸杞籽油低、高劑量組小鼠的CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量均顯著高于模型組（p<0.05，

11、p<0.01）。表明枸杞籽油可改善慢性應(yīng)激小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞丟失。
　　b.尼式染色結(jié)果：與正常組比較，模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞胞體內(nèi)的尼氏小體減少或完全消失，細(xì)胞固縮。與模型組相比，氟西汀組和枸杞籽油高劑量組小鼠的CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊緊湊，其胞體內(nèi)部的尼氏小體清晰可見(jiàn)。表明枸杞籽油可改善慢性應(yīng)激小鼠的神經(jīng)元損傷。
　　5.免疫組織化學(xué)結(jié)果：
　　a.BDNF:與正常組相比，模型組

12、小鼠BDNF在海馬組織CA1、CA3和DG三個(gè)區(qū)的表達(dá)較弱，BDNF的平均光密度在CA1、CA3和DG三個(gè)區(qū)均顯著降低（p<0.01）。與模型組相比，各試驗(yàn)藥物組DNF在海馬組織CA1和DG兩個(gè)區(qū)的表達(dá)顯著增強(qiáng)，BDNF的平均光密度在CA1和DG兩個(gè)區(qū)均顯著升高（p<0.01）。氟西汀組（20mg/kg）和枸杞籽油高劑量組在海馬組織CA1、CA3和DG三個(gè)區(qū)的表達(dá)均顯著增強(qiáng)。BDNF的平均光密度在CA1、CA3和DG三個(gè)區(qū)均顯著升高（p

13、<0.01）。
　　b.p-CREB:與正常組相比，模型組小鼠p-CREB在海馬CA1、CA3和DG三個(gè)區(qū)的表達(dá)較弱。p-CREB的平均光密度在CA1、CA3和DG三個(gè)區(qū)均顯著降低（p<0.05、p<0.01），與模型組相比，除枸杞籽油中劑量組小鼠p-CREB只在海馬CA1區(qū)表達(dá)顯著增強(qiáng)；光密度顯著升高（p<0.01）外。其余各實(shí)驗(yàn)組小鼠p-CREB海馬CA1、CA3和DG三個(gè)區(qū)的表達(dá)均顯著增強(qiáng)，平均光密度在CA1、CA3和DG三

14、個(gè)區(qū)均顯著升高（p<0.01）。
　　c.CREB磷酸化比率:與正常組相比，模型組小鼠CREB磷酸化比率在海馬CA1、CA3和DG三個(gè)區(qū)均顯著低于正常組。p-CREB/CREB在CA1、CA3和DG三個(gè)區(qū)均顯著低于正常組（p<0.01、p<0.05）。與模型組相比，除枸杞籽油中劑量組小鼠CREB磷酸化比率只在海馬CA1區(qū)顯著上升；p-CREB/CREB顯著升高（p<0.01）外。其余各實(shí)驗(yàn)組小鼠磷酸化比率在海馬CA1、CA3和DG

15、三個(gè)區(qū)均顯著上升，p-CREB/CREB在CA1、CA3和DG三個(gè)區(qū)均顯著升高（p<0.01）。
　　6.Western blot結(jié)果
　　a.BDNF：與正常組相比，模型組小鼠海馬組織BDNF表達(dá)量顯著降低（p<0.05）；與模型組相比，氟西汀組和枸杞籽油高劑量組小鼠海馬組織BDNF表達(dá)量顯著升高（p<0.01）。
　　b.p-CREB：與正常組相比，模型組小鼠海馬組織p-CREB表達(dá)量與正常組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模

16、型組相比，枸杞籽油高劑量組小鼠海馬組織p-CREB表達(dá)量顯著升高（p<0.05）；氟西汀組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　c.CREB：與正常組相比，模型組小鼠海馬組織CREB表達(dá)量與正常組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型組相比，氟西汀組和枸杞籽油高劑量組小鼠海馬組織CREB表達(dá)量均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　d.CREB磷酸化比率：與正常組相比，模型組小鼠海馬組織中的CREB磷酸化比率顯著降低（p<0.05）。與模型組相比，氟西汀組和枸杞籽油