虎紋捕鳥蛛Kunitz型毒素基因的分子改造和表達(dá).pdf

1、研究背景:
　　 虎紋捕鳥蛛是我國特有的大型有毒蜘蛛。HWTX-Ⅺ(虎紋捕鳥蛛毒素-Ⅺ)是從虎紋捕鳥蛛粗毒中提取的一種Kunitz型多肽毒素，具有很強(qiáng)的胰蛋白酶抑制作用，研究表明可用于治療急性胰腺炎，但它同時具有阻斷鉀離子通道的作用，在動物身上表現(xiàn)出較弱的神經(jīng)毒性。其胰蛋白酶抑制活性和鉀離子通道阻斷活性的功能區(qū)域相互獨立，非常有利于毒素改造。HW11c40是從虎紋捕鳥蛛毒腺中克隆到的一種新型基因，它所編碼的Kunitz型多肽毒素

2、和HWTX-Ⅺ具有相似的空間結(jié)構(gòu)以及胰蛋白酶抑制關(guān)鍵活性殘基K14，但其不具有鉀離子通道抑制的關(guān)鍵活性殘基R25。推測，HW11c40和HWTX-Ⅺ一樣具有強(qiáng)大的胰蛋白酶抑制活性，而其鉀離子通道阻斷活性會更低。有希望通過對HW11c40進(jìn)行基因改造，消除其鉀離子通道阻斷活性，研制出治療急性胰腺炎的高效藥物。然而從天然毒液中分離的蜘蛛毒素遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足研究和開發(fā)的需要，蜘蛛毒素的獲取一直是限制其研究的難題。目前，通過基因工程表達(dá)蜘蛛毒素是一

3、種有效的人工獲取毒素的方法。
　　 研究目的:
　　 1、探索出適合HWTX-Ⅺ表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)，解決HWTX-Ⅺ研究來源問題。
　　 2、對HW11 c40進(jìn)行分子改造，以期消除神經(jīng)毒副作用，提高多肽穩(wěn)定性，獲得專一高效的胰蛋白酶抑制劑。找到適合HW11c40突變體表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)，為篩選出合適的突變體進(jìn)而研制出高效的治療急性胰腺炎及其胰蛋白酶相關(guān)性藥物奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法
　　 1、PCR克

4、隆出HWTX-Ⅺ的片段重組到載體pET-40b(+)中，構(gòu)建出重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)入至大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行周質(zhì)表達(dá)，獲得HWTX-Ⅺ的融合蛋白，通過腸激酶酶切融合蛋白釋放出HWTX-Ⅺ的目的蛋白、再經(jīng)鎳柱和色譜進(jìn)一步分離純化、最終用質(zhì)譜鑒定。并對表達(dá)的條件進(jìn)行了優(yōu)化。
　　 2、通過PCR定點突變法對HW11c40進(jìn)行分子改造后，分別轉(zhuǎn)入載體pVT102U/a和pET40b(+)中，構(gòu)建出其四個突變體[Y35C]、[

5、Y35CD39N]、[RLY56(35) LEC]及[RLY56(10)(35) LETC]的重組載體，再分別通過釀酒酵母S78真核表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌BL21(DE3)原核周質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，接著進(jìn)行分離純化，最終用質(zhì)譜鑒定。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、原核周質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出了HWTX-Ⅺ融合蛋白，經(jīng)腸激酶酶切成功釋放出目的蛋白，再經(jīng)質(zhì)譜鑒定驗證其表達(dá)成功，樣品凍干后最高量達(dá)3.4mg/L。HWTX-Ⅺ最優(yōu)表達(dá)條件

6、是無IPTG誘導(dǎo)，30度，培養(yǎng)15-20小時。
　　 2、對HW11c40進(jìn)行了成功的突變，并構(gòu)建出相應(yīng)的突變體重組載體。釀酒酵母S78真核表達(dá)系統(tǒng)只表達(dá)出HW11c40的一種突變體[Y35CD39N](HW11c40M2)。BL21(DE3)原核周質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出了所有的突變體的融合蛋白，經(jīng)腸激酶酶切后，Trince SDS PAGE鑒定證實都獲得了對應(yīng)的目的蛋白。其中[Y35C](KpnIHW11c40M1)又經(jīng)進(jìn)一步的分離

7、純化和質(zhì)譜鑒定，驗證其獲得表達(dá)。
　　 研究結(jié)論:
　　 1、首次用該原核周質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)出HWTX-Ⅺ，并對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，探索出HWTX-Ⅺ表達(dá)的新途徑。
　　 2、對HW11c40成功的進(jìn)行了分子改造，并用原核周質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出了以增強(qiáng)多肽穩(wěn)定性，降低鉀離子通道阻斷活性，提高胰蛋白酶抑制活性為目的HW11c40的4種突變體多肽毒素，證實此原核周質(zhì)表達(dá)是適合的表達(dá)系統(tǒng)。為后期活性研究，篩選出有意義的突