乙肝病毒相關(guān)性肝癌患者血清中差異表達miRNAs的篩選及其功能意義.pdf

1、目的:篩選乙肝病毒(HBV)相關(guān)性肝癌患者血清中差異表達的miRNAs，分析其作為乙肝病毒相關(guān)性肝癌診斷標志物的價值及其在乙肝病毒相關(guān)性肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法:1.選擇在肝癌組織和癌旁組織中存在差異表達的miRNAs(miR-96、miR-18a、miR-10b、miR125a和miR-378)，用real-time RT-PCR方法對小樣本(15例HBV相關(guān)性肝癌患者和15例健康志愿者血清)檢測其表達水平，以尋找在

2、血清中可能存在差異表達的miRNAs。
　　 2.基于第一步篩選的結(jié)果，選擇在HBV相關(guān)性肝癌患者血清中存在上調(diào)表達的miR-18a，用real-time RT-PCR方法對大樣本(86例HBV相關(guān)性肝癌患者和45例健康志愿者)血清檢測其表達水平，并分析其作為HBV相關(guān)性肝癌診斷標記的價值和與HBV相關(guān)性慢性肝病(肝炎及肝硬化)鑒別診斷的價值。
　　 3.采用慢病毒技術(shù)構(gòu)建miR-378過表達慢病毒。
　　 4.

3、在肝癌細胞HepG2和穩(wěn)定表達HBV的肝癌細胞HepG2.2.15，用慢病毒介導(dǎo)上調(diào)在肝癌患者血清中下調(diào)表達的miR-378，采用MTT和克隆形成實驗研究其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 5.生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-378的靶基因，熒光素酶報告實驗驗證靶基因，并用western-blot方法在細胞水平研究上調(diào)miR-378表達對其靶基因表達的影響，分析miR-378在肝癌中作用的機制。
　　 結(jié)果:1.在15例HBV相

4、關(guān)性肝癌患者和15例健康志愿者血清中檢測5個miRNAs的表達水平，與健康對照比，miR-18a在肝癌患者血清中顯著上調(diào)表達(p=0.003，Mann-Whitney檢測，下同)，而miR-378顯著下調(diào)表達(p=0.044)。miR-96、miR-10b和miR-125a在肝癌患者和健康對照間表達差異無顯著性(p均＞0.05)。
　　 2.選擇血清中表現(xiàn)上調(diào)表達的miR-18a，進一步用大樣本(86例HBV相關(guān)性肝癌患者和45

5、例健康志愿者)驗證其血清中miR-18a的表達水平，獲得與第一步實驗相似的結(jié)果，且差異具有統(tǒng)計意義(P＜0.0001)。綜合分析所有樣本(101例HBV相關(guān)性肝癌患者和60例健康志愿者)的血清中miR-18a表達水平，受試者工作特征曲線(ROC曲線)顯示，以miR-18a表達水平區(qū)分肝癌與正常人的曲線下面積為0.881，95％可信區(qū)間(CI)為0.829-0.933。以1.765為截斷值，靈敏度為86.1％，特異度為75.0％。與30例

6、HBV相關(guān)性慢性肝病(慢性肝炎和肝硬化)作血清miR-18a水平比較，肝癌患者血清miR-18a水平顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計意義(p＜0.0001)，曲線下面積為0.775(95％ CI:0.681-0.869)，以1.796為截斷值，區(qū)分肝癌與慢性肝病的靈敏度為77.2％，特異度為70.0％。
　　 3.成功構(gòu)建miR-378的慢病毒表達載體，測序證實所插入基因序列正確。熒光顯微鏡檢測證實PGCSIL-miR-378能在293T

7、細胞中表達。
　　 4.用miR-378慢病毒載體感染肝癌細胞HepG2.2.15和HepG2，并測定細胞增殖活性和克隆形成能力。結(jié)果顯示，與空載體組比較，miR-378慢病毒載體感染組肝癌細胞的增殖活性降低和克隆形成減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 5.用生物信息學(xué)方法預(yù)測Med19和IGF1R為miR-378的靶基因，熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，與對照(NC)組比，miR-378與Med193’-UTR共

8、轉(zhuǎn)染工具細胞HEK293組熒光素酶活性僅下降了9.7％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。而miR-378與IGF1R3’-UTR共轉(zhuǎn)染組熒光酶活性下降了41.8％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。同時，在肝癌細胞中上調(diào)miR-378表達后，western-blot檢測發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中IGF1R蛋白表達水平顯著降低。
　　 結(jié)論:1.在HBV相關(guān)性肝癌患者中，血清miR-18a顯著上調(diào)表達，可作為HBV相關(guān)性肝癌的非侵入性診斷標