二甲雙胍對2型糖尿病合并結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響及其機(jī)制.pdf

1、背景：目前，我國糖尿病的發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到9.7％，究其原因，主要是由于人民生活水平的提高，生活方式的迅速改變，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)病率也快速增長。糖尿病除了引起血管及神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥外，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也密切相關(guān)。研究顯示，2型糖尿病患者發(fā)生結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于一般人群。糖尿病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。二甲雙胍作為一種胰島素增敏劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于2型糖尿病患者的治療。臨床研究顯示二甲雙胍對腫瘤患者具有

2、一定的保護(hù)作用。使用二甲雙胍降糖治療的2型糖尿病患者惡性腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性與使用磺脲類降糖藥物的患者相比下降了23％，并且腫瘤相關(guān)死亡率也顯著降低。Diabetologia上的一項(xiàng)隊(duì)列研究顯示，胰島素或胰島素促泌劑的治療與惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的增加相關(guān)，聯(lián)用二甲雙胍能使其增加的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。二甲雙胍的應(yīng)用與糖尿病患者結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Zhang ZL等通過對108161名2型糖尿病患者的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，使用二甲雙胍治療可以顯著降低結(jié)直腸

3、癌的發(fā)病率。Lee JH等經(jīng)過41個(gè)月的隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，患有結(jié)直腸癌的糖尿病患者，在結(jié)腸癌術(shù)后口服二甲雙胍與其它降糖方案相比，總的死亡率及結(jié)直腸癌相關(guān)的死亡率均顯著降低。Lee MS等通過隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者結(jié)腸癌的發(fā)病率是非糖尿病患者的2倍，而口服二甲雙胍的糖尿病患者結(jié)腸癌的發(fā)病率與非糖尿病患者一致。Hosono K等通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸鏡檢有結(jié)腸變性隱窩病灶（癌前病變）的患者口服二甲雙胍(250mg/d)1個(gè)月后，病灶數(shù)目顯著

4、減少，同時(shí)腸上皮細(xì)胞的增殖能力也顯著降低。關(guān)于二甲雙胍抗癌作用的機(jī)制尚不完全清楚，目前的研究多認(rèn)為與其發(fā)揮降糖作用的機(jī)制相關(guān)。一系列的研究顯示，2型糖尿病患者的高血糖及高胰島素血癥狀態(tài)導(dǎo)致其發(fā)生惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)性顯著高于一般人群?？诜纂p胍可以降低2型糖尿病患者機(jī)體內(nèi)的胰島素抵抗、改善高胰島素血癥，從而達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的目的。近年來，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)二甲雙胍可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其本身存在著直接的抗腫瘤活性。二甲雙胍可

5、以有效激活A(yù)MP活化的蛋白激酶(AMPK)及其下游通路，使肝臟糖異生減少，同時(shí)增加外周組織對糖的攝取和利用，進(jìn)而降低血糖。AMP與人體內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、p53/p21途徑、mTOR通路、脂肪酸代謝相關(guān)通路、蛋白質(zhì)代謝相關(guān)通路等多種信號傳導(dǎo)通路相關(guān)。AMPK的活化可以阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。近來，許多研究顯示，二甲雙胍具有殺傷腫瘤干細(xì)胞的作用。腫瘤干細(xì)胞是存在于腫瘤組織中的一小部分具有干細(xì)

6、胞性質(zhì)的細(xì)胞群體，均具有自我更新能力和不定向分化潛能，可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。現(xiàn)認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤形成及其不斷生長的根源。Vazquez等研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍通過降低主要驅(qū)動因子（轉(zhuǎn)錄因子ZEB1、TWIST1、SNA12）的表達(dá)，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，從而減少乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的產(chǎn)生。Soritau等通過對Ⅲ和Ⅳ期多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行組織培養(yǎng)，從中提取的腫瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞的特征，該細(xì)胞對常規(guī)的化療藥物替莫唑胺(TMZ)

7、耐藥，而替莫唑胺合用二甲雙胍較單獨(dú)使用替莫唑胺對腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯增加。Lliopoulos等通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一定劑量的阿霉素可以抑制裸鼠體內(nèi)移植的腫瘤組織（包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌）的生長和復(fù)發(fā)，而合用二甲雙胍后原劑量1/4的阿霉素對腫瘤組織的抑制效果與之前的劑量相比，無明顯差異，考慮是由于二甲雙胍能夠特異性殺傷對化療藥物阿霉素耐藥的腫瘤干細(xì)胞。Oliveras等發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以使乳腺癌細(xì)胞MCF-7中抑癌基因let-7α的表達(dá)

8、增加18倍，阻礙TGFβ引起的原癌基因181α表達(dá)的增加，從而阻滯EMT相關(guān)的乳腺癌細(xì)胞的自我更新。二甲雙胍降低乳腺癌組織內(nèi)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志CD24的表達(dá)，而CD24可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。卵巢癌及肺癌的研究提示:二甲雙胍在抑制腫瘤組織生長、血管生成及轉(zhuǎn)移方面與化療藥物順鉑具有協(xié)同作用。5-氟尿嘧啶(5-FU)是結(jié)直腸癌的常規(guī)化療藥物，由于它療效確切，一直處于其他化療藥無法替代的地位，但一些結(jié)直腸癌病例對5-FU為主的化療并不敏感，其對5

9、-FU單藥治療的有效率僅為20％。研究發(fā)現(xiàn)，對5-FU耐藥的細(xì)胞多屬于腫瘤干細(xì)胞群。二甲雙胍對結(jié)直腸癌干細(xì)胞是否具有特異性殺傷作用，與結(jié)直腸癌的常規(guī)化療藥物5-FU之間是否具有協(xié)同作用，能否改善5-FU耐藥，降低5-FU的使用劑量，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。CD133是結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志之一。2007年，O'Brien CA等在裸鼠體內(nèi)運(yùn)用腎被膜移植實(shí)驗(yàn)鑒定了人類直腸癌的起始細(xì)胞(CC-IC)。純化實(shí)驗(yàn)證實(shí)所有的CC-ICs均為CD133+細(xì)

10、胞，CD133-細(xì)胞組成腫瘤的主要部分但不能促進(jìn)腫瘤生長。通過有限稀釋法發(fā)現(xiàn):CD133+細(xì)胞中起始細(xì)胞的含量是整個(gè)腫瘤細(xì)胞中起始細(xì)胞含量的200倍。在CD133+細(xì)胞群中的CC-ICs在連續(xù)的移植中能維持生長、分化以及重建腫瘤的異質(zhì)性。Wnt/β-catenin信號通路與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。腫瘤干細(xì)胞內(nèi)，Wnt/β-catenin通路活化，細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)增加。Wnt/β-caten

11、in通路主要由細(xì)胞外因子(Wnt)、跨膜受體(frizzled)、胞質(zhì)蛋白(β-catenin)及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(TCF)等一系列蛋白組成。細(xì)胞外因子與受體結(jié)合后，通過一系列胞質(zhì)蛋白間的相互作用，使得細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin蛋白含量增加，進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子TCF結(jié)合，兩者共同作用激活一系列的下游靶基因，包括cylinD1、c-myc等的轉(zhuǎn)錄，這些靶基因多數(shù)是與細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)的基因。結(jié)腸癌組織中，CD133陽性表達(dá)和Wn

12、t/β-catenin通路激活提示腫瘤細(xì)胞耐藥，預(yù)后不良，可以作為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記。在成骨細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠促進(jìn)β-catenin蛋白的磷酸化降解，降低細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的水平，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin通路活性?；加薪Y(jié)直腸癌的糖尿病患者，在結(jié)直腸癌術(shù)后口服二甲雙胍與其它降糖方案相比，總的死亡率及結(jié)直腸癌相關(guān)的死亡率均顯著降低，我們推測，可能與二甲雙胍能夠特異性的抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞生長，從而抑制了結(jié)直腸癌的

13、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過對南方醫(yī)院2010年1月-2012年6月期間住院的2型糖尿病合并結(jié)直腸癌患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，探討了2型糖尿病與結(jié)直腸癌的關(guān)系以及不同降糖方案對結(jié)直腸癌分化程度以及轉(zhuǎn)移的影響;免疫組化檢測了使用二甲雙胍降糖的2型糖尿病合并結(jié)直腸癌患者與未使用二甲雙胍的患者相比，手術(shù)切除的結(jié)直腸癌腫瘤組織內(nèi)CD133及β-catenin蛋白表達(dá)的差異，探討了二甲雙胍是否對結(jié)直腸癌干細(xì)胞也具有一定的殺傷作用;細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測

14、了二甲雙胍預(yù)處理能否夠增強(qiáng)常規(guī)化療藥物5-FU對結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的抑制作用及其可能機(jī)制，從而為二甲雙胍應(yīng)用于結(jié)直腸癌的預(yù)防和治療提供一定的理論依據(jù)。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一章：2型糖尿病合并結(jié)直腸癌患者的臨床特點(diǎn)。
　　 目的：探討2型糖尿病合并結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征及降糖藥物二甲雙胍對腫瘤分化程度及轉(zhuǎn)移的影響。
　　 方法：⑴采用統(tǒng)一的調(diào)查表，記錄南方醫(yī)院2010-1-1至2012-6-30期間

15、住院治療的病案資料齊全的2型糖尿病合并結(jié)直腸癌患者的臨床資料，病例共計(jì)187例，其中男性患者107例，女性患者80例。⑵調(diào)查表的主要內(nèi)容包括:性別、年齡、2型糖尿病病程、體重指數(shù)(BMI)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、尿素氮（BUN）、肌酐(CR)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、降糖藥的

16、使用情況，結(jié)直腸癌病理分級、結(jié)直腸癌淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等。⑶采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果及臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，總結(jié)結(jié)腸癌合并糖尿病患者的臨床特點(diǎn)，計(jì)量資料用x±sd表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)(％)表示，采用X2檢驗(yàn);P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①187例2型糖尿病合并結(jié)直腸癌患者的平均年齡為63.24±11.29歲，平均糖尿病病程為5.25±5.36年，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌時(shí)才診斷糖

17、尿病的患者占47.06％，患者臨床計(jì)量資料的單樣本t檢驗(yàn)顯示，除外FBG和HbA1c外，患者的其它資料基本在正常范圍內(nèi)（95％可信區(qū)間）。②患者結(jié)直腸癌的病理類型以中分化腺癌為主，占51.34％，其次為高分腺癌(26.20％)，低分化腺癌(7.9％)，粘液腺癌(10.70％)。其它病理類型分別為:印戒細(xì)胞癌1例;管狀絨毛狀腺瘤，伴局部癌變1例;病理類型不詳伴廣泛轉(zhuǎn)移4例。③患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為25.67％;肝轉(zhuǎn)移16例(8.56％);肺轉(zhuǎn)

18、移5例(2.67％);腹腔轉(zhuǎn)移5例(2.67％);盆腔轉(zhuǎn)移2例(1.07％);膀胱侵犯2例(1.07％)。④按照降糖藥物的使用情況，將患者分為二甲雙胍組和非二甲雙胍組，二甲雙胍組患者低分化腺癌比例及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率均顯著低于非二甲雙胍組，提示二甲雙胍組患者結(jié)直腸癌的預(yù)后較好。
　　 結(jié)論：⑴2型糖尿病合并結(jié)直腸癌患者，占同期南方醫(yī)院住院的結(jié)直腸癌患者的12.74％，其中，高達(dá)47.06％的患者是在已經(jīng)診斷結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)上，入院常規(guī)檢查

19、時(shí)才診斷了2型糖尿病，與我國糖尿病患病率高、檢出率低的現(xiàn)狀是相符合的?；颊呖崭寡堑钠骄綖椋?.27±2.58）mmol/L，糖化血紅蛋白的平均水平為（7.25±1.65）％，血糖控制差，不利于腫瘤的治療。⑵研究中的187例2型糖尿病合并結(jié)直腸癌患者，初診結(jié)直腸癌時(shí)已經(jīng)合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者為29例，占15.51％，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后差;⑶二甲雙胍組與非二甲雙胍組患者相比，二甲雙胍組患者結(jié)直腸癌中低分化腺癌比例、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率均低于非二甲雙胍組

20、，提示二甲雙胍組患者結(jié)直腸癌的預(yù)后較好。
　　 第二章：二甲雙胍對結(jié)直腸癌組織中CD133及β-catenin蛋白表達(dá)的影響。
　　 目的：探討二甲雙胍對結(jié)腸癌組織中復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)CD133及1β-catenin表達(dá)的影響。
　　 方法：⑴以2010年1月至2012年6月南方醫(yī)院普外科住院的2型糖尿病合并結(jié)腸癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織為研究對象，其中二甲雙胍組19例（組織病理分級為:高分化者3例，中分化者1

21、5例，低分化者1例），非二甲雙胍組18例（組織病理分級為:高分化者4例，中分化者11例，低分化者3例）。⑵免疫組織化學(xué)方法觀察兩組標(biāo)本中CD133及β-catenin蛋白表達(dá)的差異。⑶采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行X2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①二甲雙胍組患者結(jié)直腸癌組織中CD133蛋白陽性表達(dá)率為21.1％(4/19)，非二甲雙胍組陽性表達(dá)率為50％(9/18)。非二甲雙胍組CD133陽性表達(dá)率

22、高于二甲雙胍組，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.065)。②二甲雙胍組患者結(jié)直腸癌組織中β-catenin蛋白陽性表達(dá)率為36.8％(7/19)，非二甲雙胍組陽性表達(dá)率為72.2％(13/18)，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)。
　　 結(jié)論：⑴二甲雙胍組與非二甲雙胍組患者相比，二甲雙胍組患者結(jié)直腸癌組織中CD133及β-catenin蛋白的陽性表達(dá)率均低于非二甲雙胍組，可能是二甲雙胍改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后的機(jī)制之一。⑵術(shù)

23、前未進(jìn)行放化療的2型糖尿病合并結(jié)直腸癌患者手術(shù)標(biāo)本數(shù)量有限，本研究具有一定的局限性，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入探討。
　　 第三章：二甲雙胍預(yù)處理對5-氟尿嘧啶抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖的影響及其機(jī)制。
　　 目的：探討二甲雙胍預(yù)處理能否增強(qiáng)化療藥物5-FU對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的抑制作用及其可能機(jī)制。
　　 方法：⑴以人結(jié)腸癌株SW620為實(shí)驗(yàn)對象。采用含10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于

24、37℃、5％ CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。⑵MTT法測定各組細(xì)胞的增殖能力。⑶流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及CD133+細(xì)胞比例。⑷免疫印跡法(Western Blot)檢測各組細(xì)胞總蛋白及細(xì)胞核蛋白內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)水平。⑸采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各指標(biāo)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±sd)表示，各組均數(shù)比較采用方差分析，方差齊時(shí)，多重比較采用LSD法(Least-significant difference te

25、st)檢測，方差不齊時(shí)，多重比較采用Tambane'sT2法檢測。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①M(fèi)TT法觀察三種細(xì)胞的增殖情況:24 h，5-FU組細(xì)胞的OD值與MET+5-FU組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;48h和72 h，5-FU組細(xì)胞的OD值低于MET+5-FU組，兩組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。②正常對照組、5-FU組、MET+5-FU組細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例分別為(43.06±2.75)％

26、;(39.62±0.88)％;(24.14±6.01)％，三組細(xì)胞間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.562，P=0.002)，MET+5-FU組S期細(xì)胞比例顯著低于5-FU組(P=0.003)。③正常對照組、5-FU組、MET+5-FU組細(xì)胞早期凋亡率分別為(1.333±0.351)％，(1.767±0.611)％，(3.500±1.082)％，三組細(xì)胞早期凋亡率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.098，P=0.026)，SW620組與5-

27、FU組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.503)，5-FU組與MET+5-FU組相比具有顯著差異(P=0.029);④正常對照組、5-FU組、MET+5-FU組細(xì)胞晚期凋亡率分別為(3.667±0.252)％，(9.467±2.003)％，(18.233±1.159)％，三組細(xì)胞晚期凋亡率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=81.728，P=0.006)，各組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑤正常對照組、5-FU組、MET+5-FU組細(xì)

28、胞內(nèi)CD133+細(xì)胞比例分別為(27.63±2.58)％，(21.30±1.40)％，(15.13±3.43)％，三組細(xì)胞間CD133+細(xì)胞比例的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.254，P=0.003)，各組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。⑥正常對照組、5-FU組、MET+5-FU組細(xì)胞總蛋白內(nèi)β-catenin蛋白的相對表達(dá)量分別為0.936±0.005，0.884±0.017，0.463±0.061，三組細(xì)胞總蛋白中β-ca

29、tenin蛋白表達(dá)量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=82.531，P=0.000);⑦正常對照組、5-FU組、MET+5-FU組細(xì)胞核蛋白內(nèi)β-catenin蛋白的相對表達(dá)量分別為1.890±0.242，1.760±0.342，1.163±0.242，三組細(xì)胞核蛋白中β-catenin蛋白表達(dá)量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.774，P=0.040）;⑧MET+5-FU組細(xì)胞總蛋白及細(xì)胞核蛋白內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)均顯著低于5-FU組(

30、P＜0.05)，5-FU組與SW620組之間的差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：⑴二甲雙胍預(yù)處理增強(qiáng)了5-FU對結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖的抑制作用，細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例顯著降低，細(xì)胞凋亡率增加。⑵二甲雙胍預(yù)處理增強(qiáng)了5-FU對結(jié)腸癌細(xì)胞SW620中CD133+細(xì)胞的殺傷作用，抑制了細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin通路活性。⑶二甲雙胍與結(jié)直腸癌常規(guī)化療藥物5-FU具有協(xié)同作用，有可能作為一種新的輔助治療方式，提