ErbB2入核機制研究初探.pdf

1、ErbB2作為細胞表面膜受體與其它EGFR家族成員形成異源二聚體而發(fā)揮作用．最近的研究報道ErbB2可定位于細胞核，并作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控某些基因的轉(zhuǎn)錄。對于ErbB2分子能否入核一直存有爭議。 本研究第一部分將全長ErbB2融合于GFP N端，發(fā)現(xiàn)全長ErbB2在過表達的情況下不入核。病毒蛋白PF-8的NLS亦不能有效驅(qū)動ErbB2全長分子的核轉(zhuǎn)位，表明ErbB2分子的固有特性使其更傾向定位于胞膜。對ErbB2的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)

2、，ErbB2 ICD N端含有一個假定的NLS。通過構(gòu)建不同形式的ErbB2突變體，采用間接免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡術(shù)觀察到，ErbB2 ICD具有顯著的入核傾向，去除此NLS雖然不能完全阻斷ErbB2 ICD的核定位，但對其入核可產(chǎn)生較明顯的干擾作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ErbB2 ICD分子內(nèi)蘊藏決定其細胞內(nèi)定位的重要信息，在不同種屬EGFR家族成員中897位精氨酸具有高度的保守性，含有<,896>RRR<,898>三聯(lián)精氨酸的序列(

3、殘基721-970)與ErbB2胞質(zhì)內(nèi)定位相關(guān)。 雖然ErbB2的核定位已在腫瘤組織中被檢測到，但在培養(yǎng)的腫瘤細胞中，ErbB2入核一直未被廣泛認同。腫瘤微環(huán)境對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有至關(guān)重要的意義，特別是間質(zhì)細胞與腫瘤細胞的交互作用直接影響腫瘤細胞的黏附、移動、增殖、分化和侵襲。本研究第二部分模擬體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，將乳腺癌細胞系SKBR3細胞與纖維肉瘤細胞系HT1080共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)兩種細胞的共培養(yǎng)能促進HT1080細胞中MMP

4、-2和MMP-9表達乃至激活，而SKBR3細胞與HT1080細胞單獨培養(yǎng)均不能產(chǎn)生激活形式的MMP-2和MMP-9。同時，共培養(yǎng)可導(dǎo)致SKBR3細胞形態(tài)學(xué)的顯著變化，細胞由圓形變?yōu)椴灰?guī)則形，胞體增大，胞質(zhì)伸出多個突起，呈現(xiàn)細胞運動的形態(tài)。細胞遷移實驗顯示細胞的遷移能力明顯增強，提示腫瘤間質(zhì)細胞對于腫瘤實質(zhì)細胞的惡性演進具有至關(guān)重要作用。共培養(yǎng)實驗及用HT1080細胞培養(yǎng)上清處理SKBR3細胞可導(dǎo)致SKBR3細胞表達的ErbB2 ECD波

5、有效切割，且隨處理時間的延長裂解效應(yīng)更加顯著，提示間質(zhì)細胞及其分泌的蛋白水解酶與乳腺癌細胞釋放ErbB2 ECD密切相關(guān)。這種酶解作用可被EDTA有效地抑制，佐證了ErbB2 ECD的切割可能與MMP-2和MMP-9的活化有關(guān)。進一步模擬腫瘤組織內(nèi)部因腫瘤細胞快速增殖而造成的缺氧環(huán)境，將SKBR3細胞進行缺氧培養(yǎng)12 h，觀察到大量ErbB2蛋白聚集于SKBR3細胞核一側(cè)，并清楚地觀察到ErbB2分子沿核的一側(cè)已“滲透”進入胞核內(nèi)。而單

6、純?nèi)毖趸騿为欻T1080細胞培養(yǎng)上清處理，均未能觀察到ErbB2的核轉(zhuǎn)位，提示間質(zhì)細胞與腫瘤細胞的相互作用及腫瘤組織的缺氧微環(huán)境是誘導(dǎo)ErbB2核定位的先決條件。 總之，本研究通過構(gòu)建不同ErbB2突變體表達載體并轉(zhuǎn)染細胞，理論上證實ErbB2有入核潛能，進而在腫瘤細胞和間質(zhì)細胞共培養(yǎng)及缺氧條件下成功誘導(dǎo)了ErbB2的核轉(zhuǎn)位。但是，目前我們尚不能確定發(fā)生核定位的ErbB2分子為何種形式。與HT1080細胞共培養(yǎng)或用HT1080細