地塞米松抗暈動病作用機(jī)制及應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景:
　　 暈動病是指由自身運動或感受到環(huán)境運動而產(chǎn)生的一種不適感，常表現(xiàn)為面色慘白、冷汗及出現(xiàn)惡心嘔吐反應(yīng)等。地塞米松是一種合成性類固醇類藥物，廣泛應(yīng)用于應(yīng)對化療和手術(shù)引發(fā)的惡心嘔吐反應(yīng)，且療效明顯。1986年，KOHL等人發(fā)現(xiàn)地塞米松具有調(diào)節(jié)暈動病的作用，且由于作用時間長、不易耐受及無嗜睡、記憶力受損、注意力不集中等中樞抑制作用，而優(yōu)于東莨菪堿聯(lián)合安非他明預(yù)防暈動病，但地塞米松抗嘔吐的機(jī)制尚不明確。
　　 在拋

2、物線飛行實驗中發(fā)現(xiàn)，暈動病發(fā)生時會出現(xiàn)明顯的外周內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)反應(yīng)降低的表現(xiàn);本教研室的研究發(fā)現(xiàn)，在對加速度暴露后惡心嘔吐者和無惡心嘔吐反應(yīng)者的代謝物質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，惡心嘔吐者體內(nèi)花生四烯酸出現(xiàn)了明顯的升高，而花生四烯酸是內(nèi)源性大麻素的下游代謝產(chǎn)物，這些研究結(jié)果提示內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)與暈動病的神經(jīng)生物發(fā)生機(jī)制有關(guān)。而糖皮質(zhì)激素與內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)之間具有相互調(diào)節(jié)的作用。并且，研究者通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性和外源性大麻素可以作用于大麻素CB1

3、受體，通過外周和中樞機(jī)制發(fā)揮抗嘔吐的作用。
　　 在動物實驗中我們發(fā)現(xiàn)，單獨使用醋酸地塞米松對抗大鼠暈動病，雖然效果明顯，但具有明顯降低大鼠體重的不良反應(yīng)，本教研室通過前期研究發(fā)現(xiàn)醋酸地塞米松聯(lián)合人參皂苷具有抗暈動病的作用，且不影響大鼠體增重。人們通過研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1是糖皮質(zhì)激素受體的功能性配體，具有糖皮質(zhì)激素樣作用，還可增強(qiáng)大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力;而人參皂苷Re可以明顯減少化療藥物順鉑，造成大鼠高嶺土的攝入量，提示其具有抗

4、化療藥物造成的惡心嘔吐反應(yīng)的作用。
　　 我們比較了大鼠在無暈動病、發(fā)生暈動病及給予地塞米松抗暈動病情況下，血漿中內(nèi)源性大麻素花生四烯酸乙醇胺(AEA)與2-花生四烯酸-甘油(2-AG)的含量;檢測迷走神經(jīng)復(fù)合體和胃中這兩種物質(zhì)的代謝酶—N-?；?磷脂酰肌醇磷脂酶D(NAPE-PLD)、二酰甘油脂肪酶(DAGL-a)、脂肪酰胺水解酶(FAAH)、單酰甘油脂酶(MAGL) mRNA表達(dá)，以及在迷走神經(jīng)復(fù)合體和胃中，與內(nèi)源性大麻素抗

5、惡心嘔吐作用密切相關(guān)的大麻素CB-1受體的表達(dá)情況;并使用大麻素CB-1受體拮抗劑(AM-251)拮抗內(nèi)源性大麻素受體，從而嘗試闡述內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在暈動病中的作用，以及地塞米松抗暈動病可能的作用機(jī)制;此外，通過比較大鼠暈反應(yīng)指數(shù)，記錄大鼠體重變化情況;觀察大鼠自發(fā)活動次數(shù)與總路程、大鼠轉(zhuǎn)棒活動時間，來研究醋酸地塞米松聯(lián)合不同劑量人參皂苷Rg1、Re對模擬暈船刺激大鼠抗暈動病以及減輕單用醋酸地塞米松不良反應(yīng)的作用。
　　 研究目

6、的:
　　 通過對地塞米松抗暈動病作用機(jī)制的初步探討，以及對醋酸地塞米松聯(lián)合人參皂苷Rg1、Re抗大鼠模擬暈船刺激的研究，為地塞米松抗暈動病的臨床應(yīng)用奠定動物實驗基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 一、地塞米松抗大鼠暈動病的作用機(jī)制研究
　　 （一）實驗動物分組
　　 33只SD大鼠，六周齡，體重在190g-240g之間（購自中英合資上海西普爾-必凱實驗動物有限公司），適應(yīng)性喂養(yǎng)5天，按體重隨機(jī)分為四

7、組。對照組(n=8)，觀看加速度刺激過程，感受加速度刺激聲音，但不給予加速度刺激;加速度刺激模型組(n=8)，灌胃水30分鐘后給予加速度刺激;地塞米松組(n=8)，灌胃地塞米松(0.05mg/kg)30分鐘后給予加速度刺激;AM-251/地塞米松組(n=9)，灌胃AM-251(5mg/kg)，15分鐘后灌胃地塞米松(0.05 mg/kg)，30分鐘后給予加速度刺激。地塞米松給予的劑量和方式都是通過本教室前期試驗比較得出的。
　　

8、 （二）加速度暴露及動物組織處理
　　 1、加速度刺激方法
　　 將加速度刺激模型組，地塞米松組，AM-251/地塞米松組大鼠放入按Crampton等報道仿制的旋轉(zhuǎn)裝置內(nèi)，繞垂直軸順時針旋轉(zhuǎn)，以16°/s2角加速度加速至120°/s2，再以48°/s2角減速度減速至零，交替加、減速進(jìn)行，持續(xù)30分鐘。對照組大鼠靜置30分鐘，觀看加速度刺激過程，感受加速度刺激聲音。實驗結(jié)束后立即檢測大鼠的暈反應(yīng)指數(shù)。
　　 2、暈

9、反應(yīng)指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)
　　 暈反應(yīng)指數(shù)的評價標(biāo)準(zhǔn)包括:排便顆粒每個記1分，無則記0分;小便有記1.2分，無記0分;立毛嚴(yán)重記1.2分，輕微記0.6分，無記0分;顫抖記1.2分，無記0分;暈反應(yīng)指數(shù)是這四部分分?jǐn)?shù)的總和。
　　 3、動物組織處理
　　 大鼠模擬暈船刺激結(jié)束后，用10％水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉，心臟穿刺取血，室溫靜置30min后，以3000rpm4℃離心20 min，收集血漿，置于-80℃保存

10、。心臟灌流0.9％NaCl溶液，取迷走神經(jīng)復(fù)合體和胃組織，置于-80℃保存。
　　 （三）大鼠血漿AEA，2-AG水平的測定
　　 HPLC-MS/MS方法檢測對照組，加速度刺激模型組和地塞米松組大鼠血漿中AEA、2-AG的水平。
　　 （四）大鼠迷走神經(jīng)復(fù)合體及胃組織NAPE-PLD、DAGL-a、FAAH、及MAGL mRNA表達(dá)的測定
　　 采用實時定量熒光PCR法測定大鼠迷走神經(jīng)復(fù)合體和胃組織中N

11、-酰基-磷脂酰肌醇磷脂酶D(NAPE-PLD)，二酰甘油脂肪酶(DAGL-a)，脂肪酰胺水解酶(FAAH)，單酰甘油脂酶(MAGL) mRNA的表達(dá)水平。
　　 （五）大鼠迷走神經(jīng)復(fù)合體及胃組織中cannabinoid-1受體(CB1R) mRNA表達(dá)及蛋白含量的測定
　　 采用實時定量熒光PCR法測定大鼠迷走神經(jīng)復(fù)合體和胃組織中CB1R mRNA的表達(dá)水平，western-blot法測定大鼠迷走神經(jīng)復(fù)合體和胃組織中CB

12、1R的蛋白含量。
　　 二、醋酸地塞米松聯(lián)合人參皂苷Re，Rg1抗大鼠暈動病作用效果的研究
　　 （一）實驗動物分組
　　 雄性SD大鼠(250g-300g)，54只，購自中英合資上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。每籠飼養(yǎng)5只，適應(yīng)期內(nèi)動物自由進(jìn)食普通飼料和飲水。動物飼養(yǎng)實驗室環(huán)境溫度22℃±2℃，濕度50％～60％，室內(nèi)照明控制在12/12hr晝夜節(jié)律變化(8:00～20:00光照)。SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，按

13、體重隨機(jī)分成8組，即空白對照組(n=6)，灌胃蒸餾水1ml/100g體重;加速度刺激模型組(n=6)，灌胃蒸餾水1ml/100g體重;Rg1和Re組(n=6)，灌胃Rg1，2mg/kg體重，Re，0.5 mg/kg體重;陽性藥物對照組(n=6)，灌胃東莨菪堿1mg/kg體重;醋酸地塞米松組(n=6)，灌胃醋酸地塞米松0.05mg/kg體重;組方低劑量組(n=8)，灌胃醋酸地塞米松0.05mg/kg體重，Rg1，1mg/kg體重，Re0.

14、2mg/kg體重;組方中劑量組(n=8)，灌胃醋酸地塞米松0.05mg/kg體重，Rg1，2mg/kg體重， Re0.5mg/kg體重;組方高劑量組(n=8)灌胃醋酸地塞米松0.05mg/kg體重，Rg1.5mg/kg體重，Re1mg/kg體重。
　　 （二）加速度暴露及暈反應(yīng)指數(shù)記錄
　　 1、加速度刺激方法
　　 將加速度刺激組、地塞米松組、組方高、中、低劑量組大鼠放入按Crampton等報道仿制的旋轉(zhuǎn)裝置內(nèi)

15、，繞垂直軸順時針旋轉(zhuǎn)，以16°/s2角加速度加速至120°/s2，再以48°/s2角減速度減速至零，交替加、減速進(jìn)行，持續(xù)30分鐘。空白對照組大鼠靜置30分鐘，觀看加速度刺激過程，感受加速度刺激聲音。實驗結(jié)束后立即檢測大鼠的暈反應(yīng)指數(shù)。
　　 2、暈反應(yīng)指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)
　　 暈反應(yīng)指數(shù)的評價標(biāo)準(zhǔn)包括:排便顆粒每個記1分，無則記0分;小便有記1.2分，無記0分;立毛嚴(yán)重記1.2分，輕微記0.6分，無記0分;顫抖記1.2分，無

16、記0分;暈反應(yīng)指數(shù)是這四部分分?jǐn)?shù)的總和。
　　 （三）體質(zhì)量改變情況
　　 每日上午9點稱量大鼠體質(zhì)量。
　　 （四）轉(zhuǎn)棒實驗
　　 模擬暈船刺激結(jié)束后立即置于轉(zhuǎn)棒儀上，記錄大鼠在轉(zhuǎn)棒儀上活動的時間。
　　 （五）自發(fā)活動實驗
　　 大鼠在模擬暈船刺激結(jié)束后立即置于全封閉自主運動箱中，紅外線自動跟蹤動物3分鐘的運動，數(shù)據(jù)均采用Winfast軟件進(jìn)行實時記錄并計算運動軌跡和參數(shù)。
　　

17、 三、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與處理
　　 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。多組間采用單因素方差分析及重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析，各組間兩兩比較采用LSD檢驗和SNK-q檢驗;實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、地塞米松抗大鼠暈動病作用機(jī)制的研究
　　 （一）四組大鼠間暈動病嚴(yán)重程度比較
　　 加速度暴露后，加速度刺激模

18、型組大鼠暈反應(yīng)指數(shù)(MSI=12±3.31)與空白對照組(MSI=3.2±1.0)相比，出現(xiàn)了明顯的升高(P＜0.001);地塞米松組大鼠暈反應(yīng)指數(shù)(MSI=4.4±1.36)與空白對照組(MSI=3.2±1.0)相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;AM-251/DEX組大鼠暈反應(yīng)指數(shù)(MSI=8.53±1.18)高于空白對照組(MSI=3.2±1.0)及地塞米松組(MSI=4.4±1.36)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001;

19、 P＜0.001); AM-251/DEX組大鼠暈反應(yīng)指數(shù)(MSI=8.53±1.18)低于加速度刺激模型組(MSI=12±3.31)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 （二）大鼠血漿中AEA,2-AG+1-AG的濃度比較
　　 AEA在三組大鼠血漿中的水平相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），分別是空白對照組(7.60±1.07 ng/ml)，加速度刺激模型組(6.19±0.98 ng/ml)，地塞米松組(

20、7.39±1.92ng/ml)。大鼠血漿中2-AG+1-AG的檢測結(jié)果為，與對照組和地塞米松組大鼠相比，加速度模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的降低（P＜0.05），三組2-AG+1-AG濃度分別是對照組(67±19.84 ng/ml)，加速度模型組(32.39±10.91 ng/ml)，地塞米松組(54.28±20.28 ng/ml)。
　　 （三）內(nèi)源性大麻素合成酶、降解酶NAPE-PLD，F(xiàn)AAH，DGL-a和MAGL mRNA在大鼠

21、迷走神經(jīng)復(fù)合體和胃中的變化情況
　　 在迷走神經(jīng)復(fù)合體中，與對照組相比，地塞米松組AEA合成酶NAPE-PLD mRNA表達(dá)明顯低于空白對照組(P＜0.01);地塞米松組AEA分解酶FAAH mRNA表達(dá)明顯高于空白對照組（P＜0.01）與加速度刺激模型組（P＜0.05）;加速度刺激組大鼠2-AG合成酶DGL-a mRNA表達(dá)明顯低于空白對照組(P＜0.001)和地塞米松組(P＜0.01）;加速度刺激組大鼠與地塞米松組大鼠2-A

22、G降解酶MAGL mRNA表達(dá)，均明顯低于空白對照組(P＜0.01;P＜0.01)。
　　 在胃組織中，三組大鼠NAPE-PLD mRNA表達(dá)比較，無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05）;加速度刺激組大鼠FAAH mRNA表達(dá)明顯高于空白對照組(P＜0.01）及地塞米松組（P＜0.05）;加速度刺激組與地塞米松組大鼠DGL-a mRNA表達(dá)均明顯高于空白對照組（P＜0.05;P＜0.05）;加速度刺激組大鼠MAGL mRNA表達(dá)明顯高于空

23、白對照組(P＜0.01）及地塞米松組（P＜0.05）。
　　 （四）大鼠迷走神經(jīng)復(fù)合體和胃組織中大麻素CB1受體mRNA和蛋白的變化情況
　　 加速度模型組大鼠迷走神經(jīng)復(fù)合體和胃組織中CB1受體mRNA表達(dá)均低于空白對照組(P＜0.05; P＜0.001)，而地塞米松組CB1受體表達(dá)與空白對照組相比沒有顯著性差異(P＞0.05）。
　　 加速度模型組大鼠迷走神經(jīng)復(fù)合體和胃組織中CB1受體蛋白表達(dá)均低于空白對照組及

24、地塞米松組(P＜0.01;P＜0.05)，而地塞米松組CB1受體表達(dá)與空白對照組相比沒有顯著性差異(P＞0.05）。
　　 二、醋酸地塞米松聯(lián)合人參皂苷Rg1，Re抗暈動病作用的動物實驗研究
　　 （一）醋酸地塞米松聯(lián)合人參皂苷Rg1，Re對模擬暈船刺激大鼠暈反應(yīng)指數(shù)的影響
　　 模擬暈船刺激后，加速度刺激模型組組大鼠暈反應(yīng)指數(shù)明顯高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。陽性藥物對照組、醋酸地塞米松

25、組、組合低、中、高劑量組大鼠暈反應(yīng)指數(shù)均低于加速度刺激模型組(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)，且陽性藥物對照組、醋酸地塞米松組、組合低、中劑量組大鼠暈反應(yīng)指數(shù)與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 （二）醋酸地塞米松聯(lián)合人參皂苷Rg1，Re對模擬暈船刺激大鼠體質(zhì)量的影響
　　 實驗前一天，實驗當(dāng)天，實驗后一天，實驗后兩天大鼠體重均發(fā)生了變化;實驗前后大鼠體重的變

26、化與空白對照組，陽性藥物對照組，加速度刺激組，Re與Rg1合劑組，醋酸地塞米松組，組方低劑量組，組方中劑量組和組方高劑量組之間有交互作用。
　　 （三）醋酸地塞米松聯(lián)合人參皂苷Rg1，Re對模擬暈船刺激大鼠轉(zhuǎn)棒活動時間的影響
　　 模擬暈船刺激之后，陽性藥物對照組大鼠轉(zhuǎn)棒活動時間，明顯低于空白對照組和加速度刺激模型組大鼠，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。組合中劑量組大鼠轉(zhuǎn)棒活動時間高于空白對照組、加速

27、度刺激組和陽性藥物對照組(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.001)。組合高劑量組大鼠轉(zhuǎn)棒活動時間高于空白對照組、加速度刺激組和陽性藥物對照組(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.001)。
　　 （四）醋酸地塞米松聯(lián)合人參皂苷Rg1，Re對模擬暈船刺激大鼠自發(fā)活動的影響
　　 1、醋酸地塞米松聯(lián)合人參皂苷Rg1，Re對模擬暈船刺激大鼠自發(fā)活動總路程的影響
　　 模擬暈船刺激之后，加速度刺激模型組、Re與Rg

28、1合劑組、陽性藥物對照組、醋酸地塞米松組大鼠自發(fā)活動總路程均低于空白對照組(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.05); Re與Rg1合劑組，醋酸地塞米松組，組方低劑量組，組方中劑量組，組方高劑量組大鼠自發(fā)活動總路程高于加速度刺激組(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001)和陽性藥物對照組大鼠(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001)。組方低、中、

29、高劑量組大鼠自發(fā)活動總路程與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　 2、醋酸地塞米松聯(lián)合人參皂苷Rg1，Re對模擬暈船刺激大鼠自發(fā)活動次數(shù)的影響
　　 模擬暈船刺激之后，加速度刺激組，Re與Rg1合劑組、陽性藥物對照組大鼠自發(fā)活動次數(shù)均低于空白對照組大鼠(P＜0.001，P＜0.05，P＜0.001);醋酸地塞米松組，組方低劑量組，組方中劑量組，組方高劑量組大鼠自發(fā)活動次數(shù)均高于加速度刺激組大鼠(P＜0