谷氨酰內(nèi)切酶和果糖氨基酸氧化酶的原核表達及在糖化血紅蛋白檢測中的應用.pdf

1、目的:
　　 原核表達和純化谷氨酰內(nèi)切酶和果糖氨基酸氧化酶,研究谷氨酰內(nèi)切酶的生物化學特性;以重組谷氨酰內(nèi)切酶和果糖氨基酸氧化酶為基礎(chǔ),建立糖化血紅蛋白酶法檢測方法并對其初步評價。
　　 方法:
　　 以PQE60GIu△Cmut5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15,經(jīng)IPTG誘導、Ni-NTA親和層析等步驟獲得重組谷氨酰內(nèi)切酶;以偶氮酪蛋白為底物測定谷氨酰內(nèi)切酶活性和米氏常數(shù),分析底物濃度、溫度、pH、金屬離子和EDTA對

2、酶活性的影響,并用SDS-PAGE電泳和質(zhì)譜研究其對Hb的水解作用。
　　 以煙曲霉菌總RNA為模板,通過RT-PCR方法擴增出果糖氨基酸氧化酶基因,克隆至原核表達載體pET32a(+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)/FAOX,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3),經(jīng)IPTG誘導表達和Ni-NTA純化,獲得重組果糖氨基酸氧化酶:以糖基化六肽為底物檢測重組果糖氨基酸氧化酶活性。
　　 利用谷氨酰內(nèi)切酶和果糖氨基酸氧化酶

3、的特性,建立糖化血紅蛋白酶法檢測方法,測定其準確度和精密度,并將其對臨床標本的檢測結(jié)果與實驗室己建立的HPLC法和日本愛科來HA-8160型全自動糖化血紅蛋白儀檢測結(jié)果作相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:
　　 谷氨酰內(nèi)切酶可以在M15菌中高效表達,純化后重組蛋白質(zhì)純度高,相對分子量為33 kDa,比活性為540.3 U/mg。重組谷氨酰內(nèi)切酶對偶氮酪蛋白的Km值為0.26 mmol/L,最適反應溫度為55℃,最適pH為8.0,

4、Ca2-和Mg2+能激活酶活性,Fe2+、Zn2+、Mn2+和EDTA則對酶活性有抑制作用。SDS-PAGE電泳和質(zhì)譜顯示重組谷氨酰內(nèi)切酶對血紅蛋白有特異性水解作用。
　　 用Trizol試劑提取煙曲霉菌培養(yǎng)后的菌體,獲得了煙曲霉菌的總RNA。以cDNA為模板,通過PCR擴增出約1300 bp的果糖氨基酸氧化酶基因。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET32a(+)/TAOX進行酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳可見約1300 bp的目的片段,測序結(jié)果顯

5、示所含目的基因序列正確。陽性重組質(zhì)粒經(jīng)誘導表達后,上清液純化后進行SDS-PAGE電泳,結(jié)果顯示重組果糖氨基酸氧化酶的相對分子量約65 kDa。以糖基化六肽為底物,檢測其比活性為22 U/mg。
　　 依據(jù)酶法檢測糖化血紅蛋白的原理和谷氨酰內(nèi)切酶、果糖氨基酸氧化酶的特性,建立了糖化血紅蛋白Alc雙試劑測定方法。該法對臨床高值、低值標本的CV值分別為1.05%和0.89%;對Bio-Rad公司質(zhì)控品的實測值在可接受范圍之內(nèi)。與HP

6、LC法進行比較,其回歸方程為Y=0.9772X-0.3432(r=0.9845);與HA-8160型全自動糖化血紅蛋白儀測定結(jié)果也有良好的相關(guān)性,回歸方程為Y=0.9853X-0.5604((r=0.9932)。
　　 結(jié)論:
　　 谷氨酰內(nèi)切酶和果糖氨基酸氧化酶可以分別在大腸桿菌M15和Rosetta(DE3)中獲得高效表達。純化后的重組蛋白質(zhì)具有較高的生物活性,并可以用于糖化血紅蛋白Alc的測定。建立的糖化血紅蛋白酶